腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation, LDH）是临床上常见的脊柱退行性疾病，其核心病理基础在于髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）和软骨细胞（chondrocytes）的生物学功能障碍，导致炎症微环境形成、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）代谢紊乱以及机械稳定性丧失。目前，LDH的化学药物治疗主要依赖非甾体抗炎药、肌肉松弛剂、脱水剂和短期糖皮质激素等，但这些药物面临明显的毒性、药物依赖性和有限的治疗疗效等挑战。与此同时，药用植物来源的外泌体作为天然纳米药物，通过递送植物内源性miRNA实现疾病治疗，已展现出克服复杂生物屏障、实现细胞间、组织间和物种间调控的显著优势。
杜仲（Eucommia ulmoides）作为临床骨关节炎治疗的重要药用植物，具有显著的抗炎、抗衰老和抗疲劳功效。循环拉伸（cyclic stretch, CS）作为临床常用的微创物理治疗手段，可通过调节机械敏感结构将机械信号转化为生化信号，促进细胞迁移、生长和分化，同时增强外源性治疗剂的细胞内化。基于此，近期一项研究首次提出了将杜仲来源外泌体（Eu-Exo）与循环拉伸整合的仿生平台（Eu-Exo/CS），通过多组学和单细胞RNA测序分析，系统阐明了其在LDH治疗中的多靶点精准调控机制。
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图 论文首图

杜仲外泌体的制备与表征
研究团队采用差速离心结合超速离心法从杜仲树皮中分离纯化Eu-Exo。透射电子显微镜观察显示，Eu-Exo呈现典型的杯状形态，粒径分布均匀，平均粒径为120±6.3 nm，zeta电位为-6.3±0.5 mV（图1a-c）。为全面解析Eu-Exo的生物组成特征，研究对其四大类主要成分进行了系统分析。

脂质组学分析鉴定出550种脂质类别，主要包括氧化脂肪酸（27.1%）、磷脂酰胆碱（10.1%）、甘油三酯（7.2%）、脂肪酸（6.9%）和磷脂酸（6.6%）（图1d）。这些天然脂质共同构成了Eu-Exo的囊泡外壳结构，赋予其膜流动性和融合特性，确保内部成分的稳定性。蛋白质组学分析显示，Eu-Exo中的蛋白质主要来源于叶绿体（6950种）、细胞质（4803种）、细胞核（2856种）和质膜（1570种），其中天冬氨酸蛋白酶含量最高（84.6%），该蛋白参与植物抗逆性和免疫调控（图1e-f）。核酸分析揭示Eu-Exo中含有223种可靠的miRNA（Eu-Exo-miRNAs），长度分布在18-28 nt，其中128种为已知miRNA，95种为新型miRNA（图1g）。KEGG富集分析表明这些miRNA主要参与氨基酸、糖类和脂质代谢调控。此外，研究还鉴定出1110种小分子成分，以脂质及脂质样分子（36.4%）、有机氧化合物（24.7%）和苯丙素类及聚酮类（13.1%）为主，其中京尼平苷酸（geniposidic acid）含量位居第四（3.57%）（图1h-i）。这些结果为深入理解Eu-Exo的生物特性和治疗潜力奠定了坚实基础。
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图1

Eu-Exo/CS对髓核细胞和软骨细胞的影响
为评估Eu-Exo/CS的治疗潜力，研究首先在脂多糖（LPS）诱导的病理模型中考察了其对髓核细胞（HNPC）和软骨细胞（HC-a）的影响。细胞摄取实验表明，Eu-Exo具有良好的内化特性：在12小时时，HNPC对Eu-Exo的摄取率达到34.3%，而在CS辅助下显著提升至68%；HC-a的摄取则呈现时间依赖性，16小时达到27%，CS条件下提升至34.3%（图2a-b）。共聚焦激光扫描显微镜图像进一步证实，在CS机械应力刺激下，Eu-Exo可被HNPC和HC-a高效内化。

细胞活力检测结果显示，Eu-Exo/CS显著改善了LPS诱导应激下HNPC和HC-a的存活能力，分别提升44.7%和56.3%，明显优于单独Eu-Exo（17%和29.7%）或单独CS（20.1%和36.5%）的处理效果（图2c）。同时，Eu-Exo/CS对促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的抑制作用也显著增强（图2d-f）。这些结果初步证实了Eu-Exo/CS对病理状态下髓核细胞和软骨细胞的活力改善和炎症抑制效应，体现了生物治疗与物理干预的协同优势。
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图2

Eu-Exo/CS对髓核细胞和软骨细胞的遗传学干预
为深入解析Eu-Exo/CS的治疗机制，研究通过mRNA测序分析了差异表达基因（DEGs）。KEGG富集分析显示，Eu-Exo/CS干预涉及细胞增殖、生长和分化相关的Rap1、FoxO、MAPK、TGF-β和PI3K-Akt信号通路，炎症调控相关的NOD样受体、TNF和NF-κB信号通路，以及细胞连接和细胞衰老等关键生物学过程（图3a-b）。

进一步聚焦Eu-Exo-miRNAs的递送功能，研究发现Eu-Exo/CS处理的HNPC和HC-a中分别有14种和9种上调miRNA存在于Eu-Exo中，提示这些植物来源miRNA成功递送至靶细胞（图3c-d）。这些miRNA的靶基因预测和KEGG富集分析显示其对FoxO、PI3K-Akt、Rap1和MAPK信号通路的调控作用。

分子机制验证揭示了Eu-Exo/CS的多靶点精准调控网络：在HNPC中，Eu-Exo/CS通过抑制PI3K和Akt的激酶活性，降低FoxO3磷酸化水平以削弱其核转位效应，进而下调促凋亡蛋白Bim的表达，干预PI3K-Akt-FoxO-Bim信号轴抑制细胞凋亡；同时降低Rap1、Ras小GTP酶和B-Raf的表达，抑制Rap1/Ras-B-Raf信号转导以减轻炎症激活（图3e-i）。在HC-a中，Eu-Exo/CS抑制PI3K和Akt磷酸化，降低诱导细胞周期阻滞的p15和IL7R表达，通过PI3K-Akt-p15/IL7R信号流促进软骨细胞增殖并缓解IL-7介导的持续性炎症循环；同时降低TRAF2、MSK1、磷酸化CREB、IL-1β和Fas的表达，干预TRAF2-MSK1-CREB-IL1β/Fas信号轴以抑制炎症反应和细胞凋亡（图3j-n）。此外，Eu-Exo/CS显著降低裂解型caspase-3表达约3.1倍，上调II型胶原表达1.9倍，下调MMP3表达至0.71倍，有效抑制髓核细胞凋亡并协同逆转ECM代谢失衡（图3o-p）。
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图3

Eu-Exo/CS对髓核细胞和软骨细胞的代谢干预
除遗传学调控外，研究还通过非靶向代谢组学分析了Eu-Exo/CS对细胞代谢的影响。在HNPC中，Eu-Exo/CS处理后45种代谢物上调、7种下调，代谢物集富集分析（MSEA）显示主要与肌醇相关代谢密切相关，包括肌醇代谢、肌醇磷酸代谢、磷脂酰肌醇磷酸代谢和甘油磷酸穿梭（图4a）。关键差异代谢物磷酸和肌醇的log2FC分别增加0.87和0.67，提示Eu-Exo/CS通过影响模块蛋白磷酸化或作为信使分子改善细胞信号转导（图4c）。

在HC-a中，164种代谢物上调、79种下调，与线粒体相关能量代谢呈强相关性，包括柠檬酸循环、支链脂肪酸氧化、线粒体中链饱和脂肪酸β-氧化和乙酰基团向线粒体转运等（图4b）。柠檬酸、顺乌头酸、焦磷酸、富马酸、异柠檬酸和D-葡萄糖等高置信度差异代谢物的log2FC分别增加8.35、7.94、6.53、1.81、1.5和0.85，表明Eu-Exo/CS增强了参与能量生成的物质输入（图4d）。

转录组与代谢组联合分析进一步揭示，Ras、FoxO和HIF-1信号通路以及缝隙连接在HNPC和HC-a中均具有显著相关性，涉及细胞增殖、存活、黏附和低氧环境适应（图4e-f），与上述DEGs和Eu-Exo-miRNAs靶基因的富集分析结果相呼应。这些代谢调控从信号转导和能量产生等不同角度协助退行性HNPC和HC-a从应激状态中恢复。
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图4

Eu-Exo/CS对腰椎间盘突出症大鼠行为学改善
基于体外实验的积极结果，研究进一步建立了LDH大鼠模型评估Eu-Exo/CS的体内治疗效果。通过尾椎穿刺法构建LDH模型后，大鼠接受Eu-Exo灌胃（200 μg/mL，200 μL，每2天一次，持续5周）联合尾部悬吊模拟循环拉伸（30分钟/天，持续5周）处理。

行为学评估包括下肢运动功能评分和足底热痛缩足潜伏期（PWTL）。结果显示，在治疗第7天，Eu-Exo/CS组的神经功能即较模型组显著改善；从第14天起，Eu-Exo/CS组在所有治疗组中表现出最佳的神经修复效果（图5d）。同时，Eu-Exo/CS组在第14天即显示出优于其他组的缩足时间恢复，表明痛阈显著提高（图5e）。这些结果证实Eu-Exo/CS能够改善LDH大鼠的肢体运动性能和热痛敏感性，提示其具有组织修复和炎症缓解的治疗效力。
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图5

Eu-Exo/CS对腰椎间盘突出症大鼠椎间盘组织修复
组织形态学评估进一步揭示了Eu-Exo/CS对椎间盘结构的修复作用。与空白组相比，模型组纤维环（AF）排列紊乱伴严重断裂，髓核（NP）组织缺失且细胞排列松散，软骨终板（CEP）厚度变薄、孔隙减少，AF与NP边界中断。而Eu-Exo/CS治疗后，椎间盘组织呈现AF环形排列柔软规则，NP丢失减少且呈梭形，AF与NP边界清晰，CEP结构完整（图6a）。Masson染色显示模型组胶原层向内膨出、网络紊乱，而Eu-Exo/CS组胶原排列更致密，NP胶原沉积增多，CEP厚度增加（图6b）。
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图6
定量评估表明，与模型组相比，Eu-Exo/CS组CEP厚度增加近30%，椎间隙高度降低21%，椎间盘退变评分显著缓解（图6c-e）。血清炎症因子检测显示，IL-1β、TNF-α和IL-6分别降至对照水平的0.22倍、0.26倍和0.35倍，体现了显著的抗炎效应（图6f-h）。此外，心、肝、脾、肺、肾和小肠的H&E染色显示Eu-Exo/CS处理组与空白组无显著差异，未见明显病理改变，证实了良好的体内安全性（图7）。
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图7

单细胞RNA测序揭示Eu-Exo/CS的治疗机制
为全面解析组织修复和重建的深层机制，研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对椎间盘组织进行分析。根据经典细胞特异性标志物，共鉴定出15个细胞群，包括成骨细胞、破骨细胞、髓核细胞、软骨细胞及软骨样细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、脂肪细胞、内皮细胞、红细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞（图8a-c）。

与模型组相比，Eu-Exo/CS组髓核细胞和软骨细胞比例分别增加13.1倍和1.2倍，中性粒细胞比例降低3.2倍。KEGG富集分析和GSEA分析显示，Eu-Exo/CS广泛下调了髓核细胞、软骨细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中的炎症事件（图8d）。

亚群分析揭示了Eu-Exo/CS对细胞异质性的精细调控：髓核细胞分为6个亚群（NPC0-5），伪时间分析显示模型组细胞多处于促凋亡和促炎状态2，而Eu-Exo/CS有效恢复了细胞数量（图8e-f）；软骨细胞分为3个亚群（Chondro0-2），Eu-Exo/CS将细胞从促凋亡状态1恢复至抗凋亡和细胞黏附恢复状态2和3（图8g-h）；巨噬细胞分为2个亚群，Eu-Exo/CS促进抗炎表型转化（图8j-k）；中性粒细胞分为4个亚群，Eu-Exo/CS抑制其促炎转化（图8l-m）。GSVA分析进一步证实Eu-Exo/CS在调控肌动蛋白细胞骨架和局灶黏附以及抑制NOD样受体信号通路中的作用（图8i, n）。
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图8
细胞通讯分析揭示了Eu-Exo/CS对细胞间相互作用的重塑：模型组中Sdc4相关的配体-受体相互作用占主导，可能导致蛋白聚糖聚集减少和组织生物力学特性降低；而Eu-Exo/CS组中App-CD74相互作用权重更高，可诱导炎症抑制并促进组织修复。信号通路层面，模型组中Adrenaline、RESISTIN和CLDN信号通路置信度较高，与炎症信号转导和ECM降解密切相关；Eu-Exo/CS则激活了HH、DESMOSOME和NPNT信号通路，促进细胞黏附和ECM重塑，同时激活TULP炎症消退信号通路（图9a-h）。这些结果共同表明，Eu-Exo/CS通过抑制髓核细胞和软骨细胞凋亡、重塑细胞生物力学特性和ECM、减少免疫细胞浸润并诱导表型转化，全面重塑了LDH病变微环境（图9i）。
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图9

小结
研究创新性地将纳米药物Eu-Exo与物理拉伸整合，以互补形式和仿生方式为LDH治疗提供了平行的生物学和物理学干预。Eu-Exo作为强效纳米药物，能够将其封装的功能性miRNA递送至LDH关键病理细胞——髓核细胞和软骨细胞，通过干预PI3K-Akt-FoxO-Bim、Rap1/Ras-B-Raf、PI3K-Akt-p15/IL7R和TRAF2-MSK1-CREB-IL1β/Fas等多条信号通路，精准抑制细胞凋亡和炎症反应。循环拉伸不仅作为临床物理治疗手段缓解椎间盘机械压迫，还能促进Eu-Exo的细胞内化，增强治疗效果。单细胞测序进一步揭示，Eu-Exo/CS通过调控肌动蛋白细胞骨架和细胞黏附改善组织可塑性，通过促进巨噬细胞抗炎表型转化和中性粒细胞浸润减少重塑免疫微环境。该仿生平台展现了优异的疗效和生物安全性，为LDH的临床治疗提供了新的策略和理论依据，也为纳米药物与物理干预的整合治疗模式开辟了新的研究方向。



参考文献：Y. Xu, Y.-D. Liu, J.-W. Zhan, et al., Biomimetic platform integrating therapeutic exosomes and stretch reverses lumbar disc herniation through multi-targeting accurate regulation, https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.177071


作者｜梅斯医学
编辑 | 逅思
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