慢性创面如糖尿病足溃疡、静脉性下肢溃疡和压疮等，因其愈合困难、易感染且医疗负担沉重，长期以来是临床治疗的重大挑战。传统中药白芷（Angelica dahurica）作为具有悠久民族药学历史的促创面修复植物药，其活性成分的研究正受到越来越多的关注。白芷多糖被认为是其促进组织再生的关键生物活性分子，然而天然提取方法获得的多糖存在显著的结构异质性，加之植物产地、采收季节以及提取纯化条件等因素引入的批间差异，严重制约了药理学结果的可重复性，真正的创面愈合药效团结构始终未能阐明。
为克服这些固有局限，精准化学合成策略应运而生，通过提供结构均一、定义明确的多糖分子，为深入的生物学研究奠定基础。过去十年，碳水化合物合成方法学取得了显著进展，但复杂多糖的多步合成往往仅能获得数毫克产物，严重限制了严格的体内药理学评价。因此，实现超过50个单糖单元的大型复杂多糖的克级合成，成为该领域亟待解决的关键挑战。
近期，中国药科大学、北京大学等研究机构联合攻关，成功实现了首个高度分支化白芷66聚糖的精准化学合成，并系统阐明了其最小活性结构单元，为将合成糖链转化为可行的治疗候选药物开辟了道路。
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图 论文首图

66聚糖的逆合成分析与合成策略
目标分子1是一个包含66个单糖单元和267个立体中心的高度分支化葡聚阿拉伯聚糖，其结构特征为42个单元的主链上装饰有三簇各含八个分支的阿拉伯糖侧链。该分子的化学合成面临多重挑战：相邻阿拉伯糖侧链带来的庞大空间位阻、大分子尺寸导致的偶联效率低下，以及主链中[6)-β-D-Glcα-(1,5)-L-Ara-1]二糖片段由于葡萄糖基和阿拉伯糖基残基之间的反应性差异而难以高效、立体选择性地构建。为提升合成效率，研究团队设计了精密的保护基策略：在非反应性羟基位点安装稳定的供电子苄基基团，以叔丁基二甲基硅基作为临时保护基，苯甲酰基则作为邻基参与效应的立体控制基团。这些保护基之间的相互正交性使得它们在合成序列中能够高效地安装和脱除，极大地促进了整体策略的汇聚性和可放大性。

目标多糖1通过在其高产率的阿拉伯糖α-1,5-糖苷键处进行逆合成切断，策略性地裂解为三个22单元构建模块：带有对甲苯硫基离去基的糖基供体2，以及两个相应的糖基受体片段。这些模块的汇聚组装设计通过一锅[22+22+22]糖基化反应实现，采用供体预活化糖基化策略。该策略通过分离预活化和偶联步骤，并使用单一、统一的离去基，规避了糖基构建块之间固有的反应性差异，显著减少了繁琐的中间体纯化步骤。进一步的逆合成分析针对22-mer片段2中的阿拉伯糖α-1,5-糖苷键，将其策略性拆解为四糖3和六糖4、5，从而通过一锅四组分[4+6+6+6]糖基化实现22-mer单元的汇聚组装。
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图1

四糖和六糖中间体的合成
为最大化合成效率，研究团队采用供体预活化一锅糖基化策略进行主链组装。糖基供体11经对甲苯硫基三氟甲磺酸酯预活化后，与三当量的阿拉伯糖受体7进行一锅四组分顺序糖基化，以优异的94%总收率获得四糖14。为避免后续氢化过程中的催化剂中毒并抑制异头碳异构化，对甲苯硫基通过与1-辛醇反应转化为正辛基糖苷。随后的碱性条件下脱除苯甲酰保护基，再经催化氢化，以三步81%的收率提供完全脱保护的四糖片段15。采用类似方案，高反应活性的TBS保护糖基供体6经预活化后与三当量阿拉伯糖受体7顺序偶联，以82%总收率获得四糖硫糖苷3。其中，大位阻碱2,4,6-三叔丁基嘧啶的加入对于抑制糖基化条件下酸诱导的TBS基团分解至关重要。获得四糖构建模块后，研究团队继而 targeting 两个关键六糖中间体的合成。对于六糖19的初始尝试聚焦于从三醇受体出发的直接三取代策略，预活化正交保护供体后顺序偶联两当量受体，以93%收率获得三糖中间体，经乙酰丙酰基脱保护后得到三醇。然而，尝试一步糖基化所有三个羟基始终导致低收率，双取代中间体中严重空间拥挤的形成有效阻止了第三个糖苷键的安装。鉴于此，研究团队转向基于二糖的汇聚策略，α-1,3-连接的二糖8通过供体11与受体12的偶联以克级规模合成，随后脱硅基化以91%收率获得受体9。

二糖8和9的DPAB一锅三组分[2+2+2]糖基化顺利进行，以86%总收率提供六糖19。随后的TBS脱除以91%收率获得六糖受体4。全局脱保护以四步73%的收率获得游离六糖A片段20。第二个六糖的合成 targeting 还原端带有葡萄糖-阿拉伯糖二糖的结构，O-6-TBS保护的葡萄糖供体13与阿拉伯糖受体7在-78°C下的初始糖基化因供受体反应性错配而产生硫代糖苷转移副产物，将反应温度提升至-50°C虽抑制了糖苷转移，但导致35%收率的原酸酯副产物形成。在优化条件下目标二糖21以54%收率获得，脱硅基化以96%收率生成二糖受体10。利用二糖构建模块8、9和10，汇聚式DPAB一锅[2+2+2]糖基化高效产生含葡萄糖的六糖22，收率85%，最终全局脱保护以四步78%收率提供游离六糖B片段23。
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图2

66聚糖的合成及糖库构建
22-mer重复单元的汇聚组装是整个合成策略中的关键步骤。四糖供体3经预活化后，顺序与两当量六糖受体4和一当量六糖5进行一锅[4+6+6+6]偶联，直接以77%收率产生全保护的22-mer硫糖苷2。将异头碳对甲苯硫基转化为正辛基糖苷，再经脱硅基化，以两步79%收率获得相应的22-mer辛基糖苷受体24。随后的苯甲酰基和苄基全局脱保护以74%总收率提供游离22-mer片段25。22-mer片段的高效合成验证了该策略构建α-1,5-阿拉伯糖基连接键的稳健性，为组装更大尺寸多糖奠定了坚实基础。

受此成功鼓舞，研究团队继而探索更大尺寸多糖的汇聚延伸，22-mer供体2与22-mer受体24的糖基化顺利进行，以73%收率获得保护的44-mer中间体27，随后的全局脱保护以三步52%总收率提供游离44-mer 28。获得多克级规模的中间体后，研究团队将目光投向目标66-mer多糖的组装，这一步构成了整个合成中最艰巨的挑战。使用p-TolSCl/AgOTf在-78°C下进行的一锅三组分[22+22+22]糖基化初始尝试仅以33%收率获得66-mer 29，将反应温度提升至-60°C使收率改善至41%，而进一步升高至-40°C则因44-mer中间体分解导致产物完全损失。推测低整体效率源于第二次糖基化事件，研究团队考察了NIS/TfOH介导的[44+22]偶联，但该方法同样未能产生目标66-mer。他们假设二氯甲烷中大型多糖中间体的溶剂化不足和构象刚性限制了反应性羟基的可及性，将溶剂切换为甲苯带来了显著改善，以52%收率获得66-mer 29。混合溶剂体系的系统优化揭示，二氯甲烷与甲苯1:1混合物结合p-TolSCl/AgOTf在-60°C条件下提供了最佳平衡，以优异的61%总收率获得保护的66-mer 29，最终全局脱保护以三步53%总收率提供完全脱保护的目标多糖1。这些结果共同构成了白芷多糖的首次全合成。

为系统解析构效关系，研究团队构建了全面的明确结构合成糖库，该库跨越多个长度尺度，包括大尺寸多糖（66-mer、44-mer和22-mer）、寡糖（4-mer、6-mer A和6-mer B）以及一系列中等尺寸多糖（10-mer、12-mer、16-mer和18-mer）。所有库成员在水中和PBS缓冲液中均表现出优异的溶解性，冻干后以白色絮状粉末形式获得，合成路线持续的高收率进一步凸显了克级制备的可行性。
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图3

合成多糖的多维结构表征
合成糖库的全面结构表征通过整合分析方法实现，采用一维/二维核磁共振和高分辨质谱技术。结构最复杂的22-mer、44-mer和66-mer的代表性¹H NMR谱图展示了清晰的信号归属，所有阿拉伯糖异头质子以单峰或小双峰形式出现在δ 5.0–5.3 ppm，相应异头碳出现在δ 106–108 ppm，共同表明所有阿拉伯糖残基均为α构型。相比之下，葡萄糖异头质子以偶合常数7.2 Hz的双峰形式出现在δ 4.5–4.6 ppm，相应C-1共振在δ 102 ppm，明确确立了葡萄糖单元的β构型。分子量验证采用互补的质谱技术，MALDI-TOF MS用于大尺寸全保护中间体，ESI-MS用于脱保护糖链。在负离子模式MS¹谱中，22-mer、44-mer和66-mer分别被归属为[M-2H]²⁻、[M-4H]⁴⁻和[M-4H]⁴⁻。碰撞诱导解离MS/MS产生可重复的碎片，以糖苷键断裂为主，同时伴有阿拉伯糖残基的诊断性跨环碎片。在高m/z区域，谱图特征为电荷态依赖的阶梯式系列，源于从非还原端顺序中性丢失阿拉伯糖单元对主链进行逐步截短，对于66-mer，从m/z 2234到2036的进展形成清晰的阶梯，与连续的132 Da丢失一致，直接反映了重复单元结构。
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图4

伤口愈合活性的体外评价
成纤维细胞是皮肤损伤后组织修复的关键介导者。细胞增殖实验筛选发现多种糖链显著增加人皮肤成纤维细胞的活力，热图分析显示12-mer和6-mer B最显著地增强成纤维细胞活力，尤其在100–200 μg/mL浓度范围内。基于增殖数据集的偏最小二乘判别分析揭示12-mer和6-mer B形成一个明显区别于其余糖链的独立聚类，提示共享且稳健的生物学活性谱。与此发现一致，划痕愈合实验和EdU掺入实验表明两种糖链均显著促进成纤维细胞迁移和增殖，6-mer B在这些实验中始终表现出优于12-mer的效力。虽然12-mer在其序列中含有完整的六糖表位，但活性降低可能反映了活性药效团在每质量基础上的有效稀释，以及增加的链长在空间上阻碍了与潜在受体的最佳结合。

为全面评估多种相关细胞类型的伤口愈合功效，两种先导糖链进一步在角质形成细胞和巨噬细胞中进行评价。12-mer和6-mer B均在10–100 μg/mL浓度下显著增强角质形成细胞增殖，并明显加速划痕实验中的细胞迁移，6-mer B在24小时时间点诱导比12-mer更快速的创面闭合。在巨噬细胞中，12-mer既不显示细胞毒性也不显示促增殖效应，而6-mer B在10–500 μg/mL范围内引发清晰的浓度依赖性细胞活力增加，这一构效关系挑战了更大糖链固有地具有更大生物活性的传统观念。

创面愈合不仅仅是实质细胞驱动的过程，还受到免疫细胞的深刻调控，研究团队继而考察活性糖链是否调节巨噬细胞表型。脂多糖刺激显著上调CD86表达，确认成功诱导促炎M1状态，与脂多糖处理组相比，两种糖链处理均显著降低CD86的平均荧光强度，同时增加M2标志物CD206的表达。M2/M1比率的定量分析揭示，与12-mer相比，6-mer B组向促再生M2表型的转变更为显著。与此表型变化一致，RT-qPCR分析显示两种糖链均下调M1标志物IL-6，同时上调M2相关基因ARG-1和IL-10，6-mer B再次显示出更优的活性。

这些结果共同证明两种糖链通过协调增强成纤维细胞和角质形成细胞功能，同时将巨噬细胞重编程为促愈合表型来促进创面修复，其中6-mer B作为最强效的最小活性单元脱颖而出。
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图5

伤口愈合功效的体内验证
受12-mer和6-mer B稳健体外活性的鼓舞，两种糖链均以克级规模合成，各获得约4.0 g材料以支持体内评价。建立小鼠全层皮肤缺损模型以进一步验证体内治疗效果，实验设对照组、12-mer处理组和6-mer B处理组。12-mer和6-mer B处理组的总体恢复效果均优于对照组，其中6-mer B处理组获得最佳结局。统计分析表明，6-mer B组第3天的创面收缩率为42.26%，比对照组高29.58%。在第5、7、10和14天，6-mer B处理组的创面愈合率均显著优于对照组并优于12-mer处理组。随后通过H&E和Masson三色染色的组织学分析评价该处理系统对创面愈合的影响，对照组显示表皮结构破坏、病理性表皮增厚、明显的炎症细胞浸润伴出血以及紊乱的胶原，而12-mer和6-mer B处理组均表现出显著增强的组织修复、减少的表皮厚度、减轻的炎症细胞浸润和增加的胶原沉积，这提示糖链通过减轻炎症和促进组织再生来加速创面愈合。Western blot分析显示，12-mer和6-mer B处理组的胶原水平和α-SMA表达均显著上调，6-mer B处理组发挥更强效的作用。此外，免疫荧光染色显示与对照组相比，12-mer和6-mer B处理组创面组织中CD206的表达水平显著升高，6-mer B诱导更强的表达，这些结果凸显了活性糖链在皮肤再生和免疫微环境中的调控作用。重要的是，6-mer B在所有指标上从宏观创面闭合到微观组织结构和分子标志物表达的优异体内表现，巩固了其作为开发新型糖基创面修复药物的高度有前景的先导候选物地位。
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图6

小结
研究建立了一个可放大且精准的合成平台，实现了结构复杂治疗性多糖的组装和最小创面愈合活性单元的鉴定。通过结合供体预活化一锅糖基化策略与汇聚式设计，研究团队首次实现了均一、高度分支化66单元白芷多糖的克级合成，以及一系列结构明确糖链片段的综合库构建。这一合成途径克服了天然提取物的固有异质性，使得原本无法开展的系统构效关系研究成为可能。通过整合的体外和体内分析，研究鉴定出还原端六糖作为一个最小但高效的活性单元，在某些情况下甚至重现并超越了全长66-mer多糖的创面愈合功效。机制上，这一结构明确的糖链通过刺激成纤维细胞和角质形成细胞的增殖与迁移，同时将巨噬细胞极化重编程为促再生表型，协调促进组织修复。该活性单元的克级生产能力使得体内验证成为可能，并在精确糖链结构与治疗功能之间建立了直接联系。更广泛而言，这项工作展示了精准化学合成如何以结构明确、机制阐明的糖治疗候选物替代可变的提取物衍生多糖制剂。除创面修复外，研究描述的合成策略和概念框架为解码复杂多糖的生物活性结构域，以及推进结构明确的糖链作为新型精准工程治疗药物类别，提供了可推广的蓝图。



参考文献：Wang J, Ruan Y, Zhao N, Lu S, Ge R, Ling J, Wells CK, Shen W, Xin G, Zhang C, Qi LW, Ye XS, Qin X. Precise Synthesis of Highly Branched Angelica dahurica Polysaccharides up to 66 Units Reveals a Minimal Motif for Wound Repair. Angew Chem Int Ed Engl. 2026 May 6:e5220143. doi: 10.1002/anie.5220143. Epub ahead of print. PMID: 42089234.


作者｜梅斯医学
编辑 | 逅思
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