肿瘤糖基化与免疫治疗的潜力

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二、糖基的分类

糖基根据其连接类型和载体分子进行分类：

糖蛋白：糖基通过特定氨基酸残基共价连接到多肽主链上。O-糖基化是一种常见的翻译后修饰，起始于N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）附着于丝氨酸或苏氨酸残基，随后进行糖链延伸。高水平的O-糖基化常见于黏蛋白上，这些蛋白在上皮细胞表面形成致密的黏液层，作为抵御外界环境的保护屏障。N-糖基化涉及碳水化合物向天冬酰胺残基的添加，所有N-糖基均含有Man₃GlcNAc₂核心，可进一步分为高甘露糖型、杂合型或复合型N-糖基。蛋白质还可通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接，形成GPI锚定糖蛋白亚类。

蛋白聚糖：以长链线性重复糖胺聚糖二糖链连接至核心蛋白为特征，包括硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素，以及非硫酸化的透明质酸（细胞外基质中的游离糖胺聚糖）。

糖脂：糖基可与脂质结合，其中神经酰胺连接的糖基或鞘糖脂是主要代表。此外，糖基还可附着于小非编码RNA，这些糖基化RNA存在于细胞表面，携带富含唾液酸化和岩藻糖基化N-糖基结构的共价糖基。

细胞糖基化的失调是癌细胞的共同特征。糖基转移酶的过表达和错误定位以及细胞代谢的改变，导致与正常细胞相比出现特异性癌糖基特征和糖基表达水平的变化。最常见的肿瘤相关糖基包括唾液酸化和岩藻糖基化结构水平升高、截断的简单O-糖基表达以及高度分支N-糖基结构的积累。这些糖基变化调节肿瘤的发展和进展，对肿瘤存活、增殖、细胞死亡抑制、血管生成、迁移、侵袭和干性维持以及治疗耐药性和免疫逃逸等多个癌症生物过程至关重要。

肿瘤糖基化的主要改变之一是表面唾液酸化的整体增加，这会引起强烈的免疫抑制，成为重要的治疗靶点。这一唾液酸化糖脂以及N-和O-糖基的增加与多种唾液酸转移酶的失调表达有关，可直接由致癌过程引起，例如在癌蛋白MYC控制下ST6GALNAC4唾液酸转移酶的过表达。ST6GAL1酶的过表达导致α2-6连接的唾液酸化N-糖基增加，通过促进存活、增殖、血管生成、迁移、侵袭和干性维持以及化疗耐药和免疫逃避，直接促进肿瘤生长和进展。ST6GAL1表达受促炎细胞因子IL-1β和IL-6上调，提示炎症反应增强了异常的唾液酸化表型。肿瘤相关的α2-3连接的唾液酸化表位也存在于岩藻糖基化的糖基结构中，如肿瘤糖蛋白和糖脂中的唾液酸-Lewis A和唾液酸-Lewis X。

除了唾液酸化和岩藻糖基化的改变，肿瘤相关N-糖基还表现出高甘露糖丰度增加，以及由于MGAT5过表达导致的高度分支结构增多。这些MGAT5修饰的N-糖基不仅促进体内肿瘤生长和转移，还通过肿瘤反应性T细胞和NK细胞主动抑制抗肿瘤免疫。N-糖基的另一种常见改变是核心岩藻糖基化水平升高，这是由岩藻糖基转移酶FUT8合成的糖基特征，与癌症侵袭性和免疫抑制相关。

癌细胞中正常O-糖基生物合成的损伤导致细胞表面暴露短截的O-糖基，如单糖Tn抗原或二糖T抗原。这些结构可进一步被唾液酸封端，分别导致α2-6连接的唾液酸-Tn或α2-3连接的唾液酸-T的表达。黏蛋白的异常糖基化，如唾液酸-Tn修饰的MUC5AC，通常与致癌特征增加和预后不良相关。

分泌型糖缀合物在临床应用中被用作重要的血清学肿瘤标志物，用于诊断、预后和疾病进展监测，包括卵巢癌中的CA125（MUC16）、乳腺癌中的CA15-3（MUC1）、前列腺疾病监测的前列腺特异性抗原、胰腺癌管理中的CA19-9（唾液酸-Lewis A）以及胃肠肿瘤随访的癌胚抗原。值得注意的是，唾液酸-Lewis A/CA19-9糖基表位不仅是生物标志物，还积极贡献于致癌过程。

靶向异常糖基化或相关凝集素受体越来越被认为是癌症治疗的一种策略。然而，目前对糖基在抗肿瘤免疫中作用的理解仍不完整，阐明其关键功能对于开发新的聚焦糖基的治疗策略至关重要。糖基的免疫调节效应可大致分为触发先天免疫受体以诱导免疫调节反应，或改变参与免疫逃避的癌细胞糖蛋白的稳定性和功能。

参与抗肿瘤免疫的凝集素主要有三个家族：Siglecs、半乳凝素和C型凝集素受体（CLRs）。Siglecs结合含唾液酸的糖基，可溶性半乳凝素结合N-和O-糖基中的N-乙酰乳糖胺（LacNAc）基序，而CLR家族成员共享保守的C型凝集素样结构域，但能够识别广泛的糖基结构。这三种凝集素家族在糖基识别谱、膜结合和/或分泌形式、细胞和组织表达谱及特定功能上存在差异，但在癌症背景下，大多数都抑制抗肿瘤免疫应答。

Siglecs

Siglecs是研究最深入的糖基结合免疫受体之一，因其能够结合唾液酸（癌细胞常过表达的一种糖基）并具有抑制性受体的固有功能。除Siglec-14、Siglec-15和Siglec-16与含ITAM的衔接蛋白DAP12结合外，所有其他人Siglecs的胞内域都含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和/或免疫受体酪氨酸转换基序。早期信号研究显示ITIM主要负责抑制细胞活化，但近期研究表明ITIM和免疫受体酪氨酸转换基序都可能参与免疫调节性SH2结构域包含磷酸酶的招募。

并非所有人Siglecs在物种间保守。保守的Siglecs包括Siglec-1、Siglec-2、Siglec-4和Siglec-15。其他人Siglecs在小鼠中没有直接直系同源物，尽管已提出非保守人鼠Siglecs之间可能存在结构和功能相似性。单个Siglecs的配体结合取决于唾液酸部分的连接方式和附近的其他糖基。Siglec配体可广泛分布在大量糖蛋白上，也可能单个糖蛋白作为特定细胞中Siglec配体的主要载体，例如CD43被报道为白血病细胞系中Siglec-7配体的主要载体。

癌细胞常过表达合成Siglec配体的酶，从而抑制先天性和适应性免疫。Siglec-7或Siglec-9的触发促进单核细胞向免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表型分化，表现为PD-L1表达增加、IL-10分泌以及抑制活化T细胞增殖的能力。Siglec-10阻止TAM对癌细胞的吞噬。重要的是，Siglec配体也可由TME中的非癌细胞（如成纤维细胞）表达，从而将髓系细胞重编程为免疫抑制表型。在CD4⁺和CD8⁺T细胞中，Siglec-10和Siglec-9分别抑制淋巴细胞活化并抑制适应性免疫。Siglec-7或Siglec-9在NK细胞表面的触发阻止其活化，并限制NK介导的细胞毒性和肿瘤细胞杀伤。由于Siglecs通过直接与肿瘤相互作用和诱导免疫抑制介质分泌，同时抑制先天性和适应性免疫分支的抗癌功能，这类凝集素构成了抗癌治疗领域的重要治疗靶点。

此外，最近发现CD28也能结合T细胞表面或抗原呈递细胞表面的唾液酸基团，这种相互作用减少了CD28与其经典配体CD80的结合，从而限制T细胞共刺激。靶向这一机制代表了增强癌症治疗中T细胞反应的有趣途径。

半乳凝素

半乳凝素是由多种细胞类型（包括肿瘤细胞）产生的蛋白质，能够结合LacNAc基序。在人体中，这12种蛋白质存在于胞质中或分泌到细胞外空间。半乳凝素根据构象分为原型（如galectin-1）、嵌合型（galectin-3）或串联重复型（galectin-9）。半乳凝素不仅在细胞和组织分布上不同，在所识别的精确含LacNAc结构上也不同。某些半乳凝素具有直接的抗肿瘤功能，结合肿瘤细胞表面配体时诱导癌细胞凋亡，但这种功能在抗肿瘤免疫背景下被认为是次要的。相反，半乳凝素与癌细胞结合通过增强抗凋亡能力、刺激促血管生成因子分泌同时降低细胞与细胞外基质的粘附，从而促进肿瘤进展。

半乳凝素也能与免疫细胞结合，在癌症治疗背景下引起了广泛关注。淋巴样和髓样细胞均可被TME中存在的可溶性半乳凝素结合，导致强烈免疫抑制。与在癌细胞中诱导凋亡类似，多个半乳凝素家族成员对T细胞具有直接细胞毒效应，例如galectin-9与Th1和CD8⁺T细胞上的TIM-3相互作用。在共表达TIM-3和PD-1的T细胞中，galectin-9交联这些糖蛋白，促进T细胞耗竭。Galectin-3通过稳定PD-1–PD-L1相互作用介导其免疫抑制效应，从而降低抗PD-1治疗的疗效。此外，galectin-7被认为能结合并触发CD4⁺T细胞表面的PD-1，进一步促进免疫抑制。半乳凝素不仅抑制TME中T细胞功能，还通过重编程内皮细胞并增强这些细胞中PD-L1的表达来限制活化T细胞对肿瘤的进入。此外，半乳凝素增强髓源性抑制细胞的免疫调节功能、增加髓样细胞免疫抑制介质的分泌，并促进巨噬细胞向抗炎表型极化。因其对TME中免疫和非免疫细胞的广泛免疫抑制效应，以及抑制免疫治疗疗效的能力，这些分子成为有吸引力的治疗靶点。已有几项旨在破坏半乳凝素效应的临床试验显示出正向效果，与抗PD-1联合使用时，抗肿瘤T细胞扩增，髓源性抑制细胞减少。

C型凝集素受体

与Siglecs和半乳凝素识别特定糖基类别不同，CLRs具有更广泛的糖基配体谱，每种受体有特异性。CLRs还能识别蛋白质、脂质或核酸，与抗肿瘤免疫相关。CLRs是多功能的，不仅作为模式识别受体，还在组织生理学和细胞-细胞通讯中发挥作用。某些CLR配体在人类和微生物间是共享的，例如Lewis抗原系统的岩藻糖基化糖基或高甘露糖结构可由哺乳动物细胞和寄生虫暴露。除少数例外，CLRs对糖基的识别通常诱导免疫抑制反应，防止先天免疫系统对免疫性自身产生反应。癌细胞利用这一机制，过表达免疫调节性糖基，包括Lewis抗原和高甘露糖糖基（被DC-SIGN和甘露糖受体结合）以及末端含GalNAc的糖基（被MGL识别）。

与Siglecs和半乳凝素相比，研究CLRs是否可作为体内治疗靶点的研究较少，部分原因是这些受体在人类和小鼠之间缺乏保守性。人DC-SIGN有五个小鼠同源物，具有不同的配体特异性和细胞分布，而MGL有两个小鼠同源物，仅MGL2的配体特异性与人蛋白重叠。DC-SIGN和MGL在结合各自配体后，都诱导包括IL-10在内的免疫抑制细胞因子分泌。小鼠DC-SIGN同源物SIGNR1在识别岩藻糖基化糖基后促进Treg细胞分化，但人DC-SIGN是否在TME中促进Treg细胞分化目前尚不清楚。尽管如此，体外阻断DC-SIGN会减少抗炎细胞因子的释放并改善CD8⁺T细胞的细胞毒反应。CLRs，特别是DC-SIGN，也在细胞-细胞相互作用中促进树突状细胞和T细胞之间的通讯，癌细胞可利用这一机制获益。例如，DC-SIGN通过结合淋巴瘤细胞的甘露糖基化B细胞受体诱导促存活信号。有趣的是，甘露糖受体是抗炎M2巨噬细胞和TAM的常见标志物，均与不良癌症预后相关，但其在抗肿瘤免疫中的确切作用尚不明确，近期研究表明甘露糖受体实际上可能促进单核吞噬细胞的抗肿瘤反应。与预防自身免疫病的作用相反，CLR DCIR实际上促进结直肠癌中的抗肿瘤免疫。C型凝集素是否以及在多大程度上促进人癌症抗肿瘤免疫并作为未来免疫疗法的靶点仍有待确定。

糖基修饰对免疫相关糖蛋白功能的影响

除了触发抑制性凝集素受体，异常癌症糖基化还通过作为蛋白质功能的关键调节因子参与其他免疫调节作用，癌细胞可利用这一点保护自身免受破坏。由这些碳水化合物构成的厚糖萼本身就是一层保护层，限制NK细胞和CD8⁺T细胞的进入和活化，这种限制由含唾液酸的糖蛋白施加，使用黏蛋白酶和唾液酸酶可恢复细胞毒性。衰变加速因子CD55的唾液酸化对于防止C3沉积在癌细胞表面和限制补体诱导的细胞裂解至关重要。高甘露糖糖基和O-糖基分别降低干扰素受体IFNγRα和死亡受体DR4、DR5的稳定性，导致对其各自配体IFNγ和TRAIL的凋亡抵抗增加。糖蛋白功能也可能以严格的糖基特异性方式改变。TNFR1受体的唾液酸化以α2-6连接进行时，而非α2-3连接时，限制其簇集——受体内化和caspase裂解的关键事件——从而增强对TNF诱导凋亡的抵抗。值得注意的是，膜糖脂控制细胞因子受体（如IFNγR）的表面表达，促进受体内化并影响对CD8⁺T细胞和NK细胞破坏的敏感性。与蛋白质糖基化相比，糖脂在调节抗肿瘤免疫中的作用远未被充分了解，靶向它们是否代表治疗机会仍不清楚。

免疫检查点分子也受糖基控制，对ICT有直接影响。PD-L1、PD-L2、B7-H5（VISTA）、CTLA-4、LAG-3、B7-H3和nectin-2已描述了多种糖基化变体。在大多数情况下，这些糖基似乎限制糖蛋白降解，导致这些检查点分子的表面表达升高，糖基化还影响其二聚化，这对与结合伙伴的相互作用至关重要。在某些特定情况下，特定的糖型促进免疫检查点降解，凸显了表征参与糖蛋白稳定性的单个酶和/或糖基功能的重要性。PD-L1的糖基化对治疗更为关键，因为它阻碍治疗性抗体的正确结合，从而限制ICT疗效。在临床前小鼠模型中，这种ICT反应不足可通过使用针对完全糖基化PD-L1的抗体或干扰肿瘤N-糖基分支或岩藻糖基化来纠正。与PD-L1类似，针对糖基化B7-H3的抗体在体内作为检查点阻断剂比针对非糖基化蛋白的抗体表现出更好的疗效。

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针对肿瘤特异性糖基或肿瘤糖基-凝集素轴的糖科学研究主要处于临床前阶段，只有少数糖基靶向疗法已接受了临床试验测试。

基于凝集素的免疫激活增强策略

虽然肿瘤通常表现出异常的糖基化谱，但只有极少数单个糖基表现出高度肿瘤特异性。事实上，许多肿瘤相关糖基存在于健康组织中，尽管密度低得多。糖基或糖蛋白的癌症专一性验证对于避免脱靶杀伤和自身免疫副作用至关重要。

靶向肿瘤相关糖基可使用针对特定糖基的抗体或与化疗药物或毒素偶联的凝集素，通过生成凝集素-抗体偶联物（lectibodies），或将其整合到CAR T细胞中。

与双特异性抗体类似，lectibodies通过凝集素结构域（来自植物、微生物或哺乳动物）靶向肿瘤糖基，并与抗CD3 scFv偶联以招募和激活免疫细胞。在一项概念验证研究中，由志贺毒素B亚基（特异性针对肿瘤相关糖脂GB3）与抗CD3 scFv偶联组成的lectibody仅在GB3⁺癌细胞上增强T细胞细胞毒性。基于此概念，设计了双特异性糖基依赖性T细胞招募器（GlyTRs），以增强肿瘤特异性和降低脱靶毒性。与lectibodies不同，GlyTRs包含L-PHA（结合高度分支N-糖基的植物凝集素）或MGL的四个亚基，利用癌细胞上异常糖基相对于健康组织的密度增加。尽管MGL和L-PHA GlyTRs均在体内显示出显著的肿瘤消退，但基于L-PHA的GlyTR在克服免疫抑制性TME方面更为有效，因其兼具检查点抑制剂和T细胞衔接器的双重功能（L-PHA是众所周知的T细胞激活剂），该分子目前被优先进行临床测试。

糖基和糖蛋白导向的CAR T细胞

针对糖脂GD2的CAR T细胞已可用超过20年，临床结果令人鼓舞。GD2是癌症特异性糖基的显著例子，尤其是在神经系统癌症中，包括髓母细胞瘤、胶质瘤和神经母细胞瘤。即使是第一代GD2 CAR T细胞治疗，神经母细胞瘤患者也能保持无癌状态超过十年，复发后的长期缓解（>18年）已有报道。第三代GD2 CAR T细胞在神经母细胞瘤和胶质瘤中显示出显著延长的抗肿瘤效应，总体缓解率超过60–70%，具有高神经学获益、延长无事件生存期甚至完全缓解。第三代GD2 CAR T细胞目前正在其他实体瘤类型（包括黑色素瘤）中进行测试，尽管安全性和可行性良好，但临床获益有限。

除GD2糖脂外，靶向其他肿瘤特异性糖基和蛋白质糖型的CAR T细胞正在开发和临床前测试中。近期描述了一种具有肿瘤唾液酸-Tn特异性且对健康组织无反应性的新CAR T细胞格式，该AIM52.1 CAR T细胞在体内控制小鼠卵巢癌和胃癌以及患者来源的胃癌异种移植物方面非常高效。然而，并非所有糖基靶向CAR T细胞在临床中都取得了成功。尽管最初有希望，但Lewis Y导向的CAR T细胞在急性髓系白血病的临床试验中失败，但仍与顺铂联合用于前列腺癌治疗的评估中。

除了抗体衍生的CAR，肿瘤相关糖基也可使用凝集素探针靶向。这些凝集素CAR使用植物或人凝集素作为识别元件，在体外和体内异种移植模型中显示出潜力。然而，鉴于凝集素受体对肿瘤和宿主糖基通常具有混杂性，这些CAR T细胞需要进一步深入分析潜在的脱靶效应和不必要的健康组织破坏。

克服毒性的一种策略是靶向肿瘤特异性蛋白质糖型。与健康组织相比，肿瘤通常表达单个蛋白质的不同糖型，因此代表了独特的治疗靶点。黏蛋白MUC1是一种著名的显示肿瘤特异性糖基化模式的蛋白质，其独特的糖变体可被CAR T细胞特异性靶向。MUC1 CAR T细胞目前正在1/2期临床试验中进行评估，但小鼠模型的数据表明，可能需要与EGFR抑制剂双重靶向或多武装CAR T细胞携带免疫刺激细胞因子才能实现治疗优势。有趣的是，EGFR抑制剂上调肿瘤相关MUC1糖型，从而创造一个反馈循环促进CAR T细胞介导的癌细胞清除。

最后，调节CAR T细胞自身的糖基化也可能改善其功能或归巢能力。使用糖基化相关基因的基因工程调节CAR T细胞的糖基化谱，也可能有助于限制TME中半乳凝素的作用。实际上，CAR T细胞表达galectin-9的配体，阻碍治疗成功。

干扰免疫调节性糖基-凝集素轴

靶向肿瘤相关糖基的替代策略是破坏有害的糖基-凝集素轴，可以通过阻断相关的凝集素受体，或重编程/编辑肿瘤的糖基化谱来实现。此方向的尝试迄今集中在干扰半乳凝素结合或唾液酸-Siglec相互作用，展示了抗Siglec-7和Siglec-9抗体通过增强ICT反应和限制肿瘤生长来增强抗肿瘤免疫的强大潜力。人源化抗Siglec-10（ONC-841）和抗Siglec-15的单克隆抗体目前正在实体瘤和转移瘤治疗的1期临床试验中。几种半乳凝素阻断剂，从抗体到碳水化合物基生物制剂和小分子抑制剂，目前正在临床前模型和1/2期临床试验中测试。

这些格式也可组合，如抗体-凝集素嵌合体（AbLecs），其中一个可变片段被凝集素结合结构域替代。凝集素结构域作为诱饵，阻断凝集素受体与抑制性糖基的相互作用，而抗体部分促进AbLec在TME中积累。AbLecs通过其Fc尾促进抗体依赖性细胞吞噬和细胞毒性，以增强抗肿瘤免疫。AbLecs的模块化格式允许轻松交换抗体结构域，从而整合其他功能，如检查点阻断剂。

除了阻断凝集素，癌细胞本身的糖基化也可以被修饰。改变细胞糖基化模式可以从内到外进行，通过抑制单个糖基转移酶或引入更广泛的通路抑制剂或糖模拟物。由于许多糖基转移酶家族内部的冗余性和高度相似性，设计高度特异性的糖基转移酶抑制剂仍具挑战性。尽管如此，N-糖基酶MGAT1和MGAT5的特异性抑制剂已有报道。MGAT1特异性抑制剂W-GTF01能纠正CD73的异常糖基化（TME中产生免疫抑制腺苷分子的外切酶），阻止异常CD73糖基化可减少三阴性乳腺癌细胞上的表面定位，从而恢复CD8⁺T细胞反应并使肿瘤对临床前模型中的抗PD-L1治疗敏感化。MGAT5抑制剂PST3.1a废除TGFβR和FAK信号传导，抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭。作为阻断单个糖基转移酶的替代方法，更广泛的通路抑制剂可能破坏N-糖基化或消除肿瘤总唾液酸化或岩藻糖基化。这些糖模拟物是修饰的单糖，进入糖基合成通路，阻止糖基结构的进一步延伸。唾液酸和岩藻糖模拟物利用糖基补救通路，使修饰糖被摄取并掺入供体糖合成中，但这些非天然糖供体不能被糖基转移酶使用，导致细胞表面唾液酸化和岩藻糖基化的整体丧失。这些唾液酸抑制剂及其下一代类似物已证实抑制肿瘤唾液酸化能改善抗肿瘤免疫并防止转移扩散。

精准糖萼编辑

干扰糖基-凝集素相互作用的另一种方法是精准糖萼编辑，即肿瘤糖基化的细胞外操作，这一概念最早由诺贝尔奖得主Carolyn Bertozzi提出。他们利用霍乱弧菌唾液酸酶的开创性工作证实了重塑细胞表面糖基以增强NK细胞毒性的可行性。肿瘤靶向的唾液酸酶还能增强免疫细胞浸润、提升免疫检查点阻断的疗效并将TAM重极化为抗肿瘤状态，表现为CD80、IL-1β和TNF表达升高。

近年来，基于原始唾液酸酶构建体的多种不同格式已被开发。唾液酸酶已与靶向肿瘤表达检查点（如PD-L1或PD-1）的抗体偶联，以改善细胞毒性T细胞反应。例如，抗PD-L1纳米抗体-唾液酸酶融合蛋白在限制结肠肿瘤生长方面比单一治疗表现出巨噬细胞依赖的协同效应。唾液酸酶也已与抗PD-1或双特异性T细胞衔接器偶联，以增强T细胞介导的肿瘤破坏。机制上，抗PD-1-唾液酸酶通过放大共刺激受体信号增强T细胞活化，从而恢复T细胞溶解能力。而添加唾液酸酶则通过加强免疫突触形成增强了双特异性T细胞衔接器的疗效。有趣的是，将PNGase-F（一种切割N-糖基的酶）与针对免疫检查点分子或生长因子受体的纳米抗体偶联，导致了这些糖蛋白的特异性去糖基化，在PD-L1的情况下还阻断了其与PD-1的相互作用。体内实验中，这些N-糖基化靶向嵌合体对多种肿瘤类型有效，表明其他糖苷酶也可被用于癌症治疗。

总体而言，靶向肿瘤糖基-免疫轴已为癌症治疗开辟了令人振奋的新机遇，一种双唾液酸酶构建体已首次进入2期临床试验。该试验目前正在研究其作为单药治疗以及与抗PD-1药物cemiplimab联合用于晚期PD-(L)1阻断耐药实体瘤的获益。尽管该领域研究仍处于起步阶段，许多临床试验结果尚未公布，但临床前工作已凸显了干扰肿瘤糖基-凝集素相互作用以增强抗肿瘤免疫和ICT的潜力。