精准肿瘤治疗中慢病毒载体的工程化改造与靶向策略

引言

基因治疗最初致力于遗传性疾病，近年来逐渐扩展到癌症应用。最突出的例子是用于癌症细胞疗法的T细胞基因工程，有望恢复肿瘤内的免疫力，在一部分患者中产生持久的反应。癌症基因治疗的应用正在增长，超过65%的正在进行的基因治疗临床试验是针对癌症治疗的。超过30种基因疗法（包括癌症治疗）已获得官方批准，其中60%用于体内给药。癌症基因治疗需要在由恶性细胞及多样化的基质和免疫细胞群组成的复杂多细胞生态系统中实现高效和选择性的基因递送。

体内基因递送系统包括非病毒和病毒载体。非病毒系统，包括物理方法、脂质纳米颗粒和聚合物载体，具有低免疫原性、可扩展性和多功能性等优势。然而，其有限的细胞进入和选择性可能解释了为什么绝大多数（83%）已批准的基因疗法是基于病毒的。

慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒（HIV-1），能够将递送的基因稳定整合到宿主基因组中，并在许多临床试验中证明了安全性和有效性，从而产生了获批药物Zynteglo（用于β-地中海贫血）和Libmeldi（用于异染性脑白质营养不良）。慢病毒载体在体内具有高基因递送效率，因此特别受关注。临床级载体也用于离体嵌合抗原受体（CAR）T细胞工程化。

慢病毒载体通过其包膜糖蛋白靶向CD4+ T细胞。病毒基因组已被广泛修饰，以去除所有致病性和复制能力的元件，同时保留高效地将治疗基因整合到宿主基因组中的能力。安全性通过使用自失活（SIN）序列、分割包装系统和假型化得到增强。

病毒趋向性由病毒表面蛋白与靶细胞之间的分子相互作用决定。假型化是产生病毒颗粒的过程，其中天然包膜蛋白被替换或工程化，从而改变颗粒的原始趋向性。本综述探讨了用于重新靶向特定细胞表面抗原的慢病毒载体假型化策略。

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二、通过病毒糖蛋白工程化重新靶向

VSV-G与活化分子的共展示

T细胞和HSPCs通常处于静息状态，VSV-G假型化载体难以转导这些细胞。一种靶向策略是在载体表面展示配体，配体与特异性受体结合后，在转导时可诱导信号传导并刺激靶细胞。

T细胞靶向： 早期的策略是将抗CD3单链抗体（scFv）与MLV包膜融合，并共表达“护送”性质的VSV-G包膜蛋白以恢复融合能力。这些VSV-G/CD3靶向载体使非活化T细胞的转导效率提高了100倍。然而，这种刺激会使T细胞转变为记忆表型，可能导致耗竭。为避免表型转换，研究者用IL-2或IL-7代替了抗CD3 scFv，与MLV-G融合。在VSV-G存在下，这些展示IL-7的LVs能高效转导未受刺激的幼稚和记忆T细胞，并保留幼稚T细胞的功能特征。

HSPCs靶向： 为克服传统LV在HSPCs转导中需细胞因子刺激导致干细胞性丧失的问题，新型LVs被设计成在其表面展示“早期作用细胞因子”，如血小板生成素（TPO）或干细胞因子（SCF）。这些展示SCF/VSV-G、TPO/VSV-G或三者共展示的LVs能够高效地将基因递送至静息HSPCs，并优先转导和促进其存活，从而在体外实现长期植入和人源化小鼠的造血重建 。

VSV-G突变体： 由于野生型VSV-G的广谱趋向性可能导致脱靶事件，研究人员利用VSV-G的晶体结构，鉴定出负责与LDL-R结合的关键残基并将其突变（K47Q和R354A），从而产生了融合能力保留但天然受体结合能力丧失的VSV-Gmut。将VSV-Gmut与表面锚定的靶向配体（如IL-13、抗CD3 scFv、抗CD19 scFv）共展示，可以实现对特定细胞（如IL-13R+细胞、T细胞、CD19+ B细胞）的特异性转导。这种称为ENTER的转导靶向工具可作为一个平台，将LV趋向性重定向到任何特定细胞类型上表达的配体 。

VSV-Gmut/靶向配体假型化策略相比其他病毒包膜具有优势，因为可以生产高滴度颗粒，但已知VSV-G对人补体敏感，可能降低体内疗效。尽管如此，多家制药公司正在推动这种重靶向LV策略进入临床试验。例如，比利时公司Esobiotec开发了一种慢病毒平台，使用靶向CD3的纳米抗体与天然受体缺陷的VSVG突变体结合，并过表达CD47以避免吞噬，通过静脉注射递送编码抗BCMA CAR的载体。在复发性或难治性多发性骨髓瘤患者的首次人体数据中，显示了两例完全缓解和两例部分缓解，CAR T细胞早期即可被检测到，但也观察到血液学毒性和细胞因子释放综合征 。

工程化多聚体病毒糖蛋白的识别单体

依赖“双组分进入系统”的基因治疗方法可能是细胞靶向治疗最强大的工具。在此系统中，融合和识别功能由两种不同的糖蛋白介导，功能上作为二聚体。这种分离允许载体特异性重靶向到所需细胞类型，同时保持高融合效率。

副粘病毒（麻疹病毒和尼帕病毒）： 通过引入突变消除MV-H蛋白对其天然受体的结合，并将其与靶向肿瘤相关抗原的scFv/DARPins融合，可以实现重靶向。例如，与IL-13融合的H蛋白使MV-LV能够特异性转导IL-13Rα2阳性的胶质瘤细胞。在癌症免疫治疗中，CD20重靶向的LVs能高效地将治疗基因递送至CD20+ B淋巴细胞。同样，CD8-LVs和CD4-LVs已被开发用于选择性靶向T细胞亚群。这些载体已被用于体内系统性生成CAR T细胞，例如CD8-LVs可生成CD8+CD19 CAR T细胞，有效清除CD19+ B细胞和肿瘤细胞，而CD4-LVs产生的CD4+ CAR T细胞不仅清除肿瘤更快，且能维持幼稚和较少耗竭的表型。此外，利用CD8-LVs生成靶向CD4+ T细胞淋巴瘤的CAR T细胞，可避免“自相残杀”现象。然而，麻疹疫苗的广泛接种导致人群中存在中和抗体，对系统性给药构成挑战。研究表明，来自尼帕病毒（NiV）的糖蛋白可能是一个合适的替代品，因其预存免疫力低，且可以绕过肝脏“蓄水池”效应。NiV重靶向的LVs已被用于递送CAR构建体，生成的CAR T细胞在体外和体内均具有功能性 。

甲病毒（辛德毕斯病毒）： 对SINV包膜糖蛋白的改造已发展出多代产品。一种策略是改造其E2糖蛋白，引入来自金黄色葡萄球菌蛋白A的ZZ结构域，能够识别免疫球蛋白的Fc段，从而将SINV与抗原/抗体复合物连接起来。利用该策略，成功实现了对HLA+、CD4+、PSCA和Her2等抗原的特异性靶向。为避免体内血清中免疫球蛋白的竞争，开发了将生物素-亲和素系统整合到E2蛋白上的新一代系统。此外，通过对E2进行改造，与靶向CCR5的scFv、靶向VEGFR2的纳米抗体、靶向VEGF的配体及整合素结合肽等融合，也成功实现了高特异性的靶向转导。最近，E2与锚蛋白结合域融合，并与靶向HER2的DARPin结合，可对约50%的HER2阳性细胞实现高效转导。

病毒颗粒可以被工程化以受体靶向的方式递送遗传信息。病毒样颗粒无病毒基因组，但具有与逆转录病毒载体相同的脂质双层膜和病毒核心。通过将糖蛋白整合到膜中，可以像载体一样改变VLPs的趋向性。

CRISPR-Cas9、碱基编辑和先导编辑等基因编辑工具在递送上存在巨大障碍。通过将MLV Gag蛋白与Cas9融合，并在生产细胞系中与gRNA共表达，研究者可以将Cas9-gRNA复合物包装进MLV来源的VLPs中。用VSV-G包膜对这些VLP颗粒进行假型化后，它们能有效地将Cas9-gRNA释放到细胞中进而实现高效基因编辑。有趣的是，使用BaEV和VSV-G包膜进行共假型化，可提高对细胞系、T细胞、B细胞和CD34+细胞的基因编辑效率。随后，研究者也成功生成了HIV衍生的VLPs，用于递送碱基编辑器或先导编辑器到肝脏、大脑和眼睛 。

为改变携带Cas9-gRNA的VLPs的趋向性，研究者使用了不同病毒的包膜蛋白进行假型化，包括：SARS-CoV-2的刺突蛋白（靶向ACE2+细胞）、尼帕病毒糖蛋白（通过EphrinB2/B3受体进入）、麻疹病毒糖蛋白（递送至CD46+细胞），以及HIV包膜（特异性靶向CD4+ T细胞）。

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