引言
CAR-T细胞疗法通过引入能够识别并结合靶抗原的合成受体，重定向T淋巴细胞以识别并清除肿瘤细胞。抗原结合后，CAR-T细胞释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性分子，诱导恶性细胞凋亡。尽管取得了成功，但多重障碍仍然限制了CAR-T疗法的更广泛影响。全身性毒性，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），可能危及生命。由于免疫抑制性肿瘤微环境、异质性抗原表达以及T细胞在实体瘤中的浸润不良，在血液恶性肿瘤之外的临床疗效有限。
从制造角度看，离体CAR-T生产复杂、劳动密集且成本高昂。该过程通常需要患者特异性T细胞采集、分离、激活、基因修饰、扩增和制剂。这些制造瓶颈导致了高昂的治疗成本并限制了患者的可及性。尽管异体方法可能降低成本，但其长期疗效尚未得到证实，如高复发率所示。此外，移植物抗宿主病（GvHD）和免疫排斥的风险仍然存在。
体内CAR-T疗法代表了一种范式转变，旨在通过将CAR转基因直接递送至患者T细胞来绕过离体制造。如果成功，这种方法可以开发出一种与异体CAR-T相比免疫原性降低的“现货型”产品，同时降低与自体制造相关的失败率。通过消除对患者来源细胞的需求，这种模式可能会降低自体离体CAR-T中观察到的制造失败率。
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一、病毒载体
病毒载体在治疗中的应用已被探索数十年，理解其结构和机制的进展加速了病毒基因递送的发展。目前有多种病毒系统可用，提供不同的特性，包括稳定或瞬时表达、可变的包装容量、多样的组织嗜性以及不同的安全性特征。这些载体通常包含三个组件：（1）目标转基因；（2）决定细胞或组织嗜性的衣壳或包膜蛋白；（3）控制稳定或瞬时基因表达的调控盒。LV、腺相关病毒（AAV）和腺病毒（AdV）载体均已获准用于临床。
慢病毒载体（LV）
LV已经历了四代发展，每一代都旨在通过修改基因构建体、保留或去除野生型基因以及整合异源元件来提高载体产量和生物安全性。其中，第三代系统因其在安全性和高效生产之间取得平衡，仍是临床应用最广泛的选择。基于LV的离体疗法已取得临床成功，包括用于癌症的CAR-T产品和用于多种遗传病的造血干细胞疗法。
LV是具有脂质包膜的颗粒，包装约80-100 nm的单链RNA基因组，容量约为8.5 kb。转导通过受体介导的内吞作用发生，其中包膜糖蛋白与细胞表面受体结合，实现融合和进入。RNA被逆转录、转运至细胞核并整合到宿主基因组中。它们稳定表达转基因以及转导分裂和非分裂细胞的能力，使LV成为一种多功能载体。大多数LV使用水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）进行假型化，这赋予了其稳定性和高滴度。然而，VSV-G的广泛嗜性引起了对其体内使用的担忧，因为它可能导致脱靶转导。
临床前研究已开始测试LV用于体内CAR-T生成，证明了肿瘤消退和癌细胞耗竭，但插入突变风险和嗜性特异性不足仍然是重大障碍。最近采用第四代LV平台的工作，结合先进的重新靶向包膜蛋白和最小化异常剪接的基因组设计，实现了高效、T细胞特异性的体内CAR-T生成。非人类灵长类动物研究表明，CAR-T细胞可持续数月持久存在，且无需传统的淋巴细胞耗竭化疗，支持了基于LV的体内产品的转化潜力。
腺相关病毒载体（AAV）
AAV载体是无包膜的，由一个包含单链DNA基因组的蛋白质衣壳组成。其嗜性取决于血清型。选择合适的血清型对于实现靶向CAR基因递送和最小化脱靶效应至关重要。AAV体积小（约25 nm），缺乏脂质包膜，包装容量约为4-6 kb，具体取决于血清型。细胞表面结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用进入，载体被转运至细胞核，转基因以染色体外状态持久存在。与LV不同，AAV基本上是非整合性的，但已在约0.1%的转染细胞中检测到整合事件。
良好的安全性、高转导效率和多功能靶向性使AAV成为体内基因治疗的领先平台。已批准的基于AAV的疗法包括治疗视网膜疾病、血友病B、遗传性视网膜营养不良和脊髓性肌萎缩症的产品。体内CAR-T应用也已得到研究，单个AAV输注在人类化肿瘤小鼠模型中递送CAR转基因，产生了稳健的CAR-T生成和肿瘤消退。然而，这些研究尚未完全表征脱靶转导，并且尚未发现具有排他性T细胞嗜性的AAV血清型，这使得衣壳进化（例如Ark313）和衣壳结合的靶向配体成为活跃的研究领域。
腺病毒载体（AdV）
与AAV相比，人腺病毒（HAdV）载体（90-100 nm）以非整合方式递送基因，将转基因维持在附加体和染色体外。其主要优势是包装容量，使用高容量载体（HCAdV）时可达37 kb。这使得能够整合自杀基因、细胞类型特异性调控元件和基因反馈回路，这些特征可能增强体内应用的疗效。
已鉴定出超过57种HAdV血清型，每种都具有不同的表面化学和介导进入的受体。HAdV-C5是研究最广泛的之一。进入是通过与柯萨奇病毒和腺病毒受体及整合素的相互作用发生的，这两者都不在人T细胞上表达。为了解决这个问题，工程化的Ad5/35载体实现了在预激活T细胞中近20%的转导效率，而未修饰的毒株则低于2%。然而，由于CD46在所有有核人细胞上表达，这种策略缺乏选择性。使用针对T细胞更特异性标志物（CD3、CD28和IL-2受体）的适配子进行进一步优化，在预激活T细胞中达到了7.6%的转导率。
虽然通常被认为是安全的，但HAdV载体可以触发不必要的免疫反应，中和抗体可能降低疗效。针对这些限制的策略正在开发中。
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二、非病毒载体
非病毒载体包括多种递送系统，包括纳米颗粒、脂质体和聚合物，旨在将治疗性载荷运送到靶细胞中。它们通常因较低的免疫原性和细胞毒性而优于病毒方法。病毒载体一个长期存在的担忧是插入突变，其中整合可能破坏肿瘤抑制基因或激活癌基因，潜在地驱动恶性转化。使用转座子/质粒DNA（pDNA）载荷的非病毒递送也存在类似风险，因为其能够实现长期表达的整合。相比之下，大多数非病毒系统递送mRNA，mRNA会迅速降解并仅支持短期表达。这最大限度地降低了突变风险。
mRNA的瞬时性质提高了安全性，但可能限制疗效，特别是对于需要稳定表达以确保肿瘤清除和防止复发的CAR-T疗法。因此，整合性和非整合性策略之间的选择取决于疾病背景、包装要求和安全性考虑。最近使用“混合”非病毒载体的工作已开始弥合这一鸿沟：靶向LNP制剂（例如NcTx）共同封装编码CAR的转座子微环DNA和SB100x转座酶mRNA，允许高效、T细胞特异性的体内CAR表达盒整合，并产生可持久数周并在人源化小鼠模型中控制B细胞白血病。
最有前景的非病毒平台是LNP和多聚复合物。前者在FDA授权的辉瑞/BioNTech和Moderna的COVID-19疫苗中得到了验证。LNP制剂通常包含四种脂质：可电离阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇（PEG）-脂质缀合物。可电离脂质对生物相容性至关重要，在生理pH下保持中性，但在酸性内体条件下质子化以促进内体逃逸。mRNA-LNP平台在体内CAR-T领域，几种具有CD3、CD7或CD8靶向配体和结构优化的可电离脂质的平台已在小鼠中实现了快速但短暂的CAR表达。相比之下，较新的基于DNA的LNP（例如NCtx）在单次给药后诱导了更高、更持久的CAR-T水平，同时保持了非病毒制造的优点。
多聚复合物在过去二十年中也获得了发展势头。这些聚合物纳米颗粒是通过带负电的核酸与阳离子聚合物自发静电缩合形成的中间多电解质复合物。最广泛使用的阳离子聚合物是聚-L-赖氨酸和聚乙烯亚胺。早期的概念验证平台实现了体内CAR-T生成，但效率适中，需要重复给药；较新的LNP系统现在在效率方面超过了这些多聚复合物。
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三、病毒与非病毒载体的特异性和脱靶效应
大多数载体表现出广泛的嗜性，缺乏细胞类型特异性。这增加了脱靶效应的风险，并可能需要更高剂量才能达到治疗效果。特异性与载体如何进入细胞密切相关：这个过程越可定制，治疗就越能精确地导向靶细胞，同时最小化脱靶进入。细胞进入主要由表面蛋白相互作用介导，这在不同的载体类型中有所不同。对于AAV和AdV，血清型通过聚糖和受体结合赋予不同的嗜性，这些自然变异可以进一步工程化以实现更大的组织特异性。LV和非病毒载体缺乏血清型多样性，而是依赖于诸如假型化替代包膜蛋白（LV）或向载体表面掺入抗体等方法。
假型化和衣壳工程化
为了克服常见LV包膜蛋白VSV-G的广泛嗜性，已探索了多种替代品。更新的基于尼帕病毒的“混合包膜”设计，结合了重新靶向和非靶向的G蛋白，以及识别CD3或CD8的紧凑型设计锚蛋白重复蛋白或重链抗体可变域，显著增加了功能性滴度和体内T细胞特异性，同时最小化了肝脏转导和脱靶髓系细胞摄取。
对于AAV，精细的血清型选择是一种既定方法，用于优化组织特异性靶向。各种工程化方法，如合理设计、定向进化（DNA改组、易错PCR、肽展示和定点诱变）以及计算机辅助设计，已被用于将嗜性重新导向野生型AAV血清型未覆盖的靶点。此外，在合理设计中，引入点突变、插入高亲和力配体或肽，以及实施化学生物学方法来合理修饰衣壳，也已显示出改善靶特异性、增加基因表达和逃避先天免疫反应的能力。
定向进化提供了一种替代方法。已经产生了T细胞增强型AAV衣壳，例如Ark313，表现出比天然血清型更高的T细胞结合和转导。它显示出与AAV6相比肝脏靶向减少，表明具有良好的安全性特征。
表面修饰
载体特异性也可以通过掺入结合靶细胞特有细胞表面蛋白的抗体来增强。CD3标记T细胞，而CD4和CD8区分主要的T细胞亚群，使它们成为CAR-T应用的合乎逻辑的靶点。DARPin为抗体提供了一种替代方案。它们的小尺寸和高热力学稳定性使其能够高效表面表达，同时减少与抗体相比的聚集。将CD8靶向的DARPin掺入AAV中导致转导增加了26倍，超过99%的GFP阳性细胞限制在CD8+细胞中。类似地，AdV-C5被工程化以携带DARPin三聚适配子，包含CD3、CD28和IL-2抗体片段，窄化了其嗜性并实现了高T细胞特异性，在外周血单核细胞中脱靶表达低于2%。
类似的表面修饰也已在非病毒系统中测试。CAR编码的mRNA-LNP功能化有CD3、NKp46和CD14靶向抗体，能够在人PBMC样本中分别转导90%的T细胞、20%的NK细胞和65%的单核细胞，在其他细胞类型中几乎没有脱靶表达。DARPin-病毒样颗粒的效率较低，转导20%的T细胞、20%的NK细胞和50%的单核细胞。这些结果表明DARPin-VLP在体内CAR-T应用中不如抗体-LNP有效，尽管该技术仍处于早期阶段。临床上多集中于CD7、CD3或CD8结合物，以重塑效应细胞群体。
另一种有前景的表面修饰方法是将阳离子、阴离子或可电离的选择性器官靶向脂质掺入LNP。在小鼠研究中，该技术已能够根据脂质组成将mRNA和其他核酸或蛋白质货物特异性地递送到肝脏、肺或脾脏。此外，嗜性可以通过可电离脂质的结构优化来引导。最近的一项研究证明了杂化脂质-聚合物纳米颗粒成功递送到脾脏。
转导前的T细胞激活
通过T细胞受体和/或增殖性细胞因子的给药进行预先激活，是离体有效转导原代T细胞的必要条件。这通常通过使用靶向CD3/CD28受体的激活颗粒，结合IL-2或IL-7/IL-15来实现。体内CAR-T生成面临的挑战是，基于颗粒的激活是不可能的。
为了克服体内T细胞激活的缺乏，已经开发了结合激活和转导的策略。例子包括CD3靶向的LV和工程化有三聚体适配子携带CD3、CD28和IL-2的HAdV-C5载体。通过在其表面掺入抗CD3和抗CD28抗体，这些LNP能够在一个步骤中同时实现T细胞激活和CAR-mRNA递送。另外，来自第四代CD3和CD8靶向LV的最新数据表明，可以在没有直接TCR参与的情况下在体内产生高水平的CAR-T细胞，前提是在载体给药前给予细胞因子支持（如IL-7）。
高效基因递送——内体逃逸
除了表面蛋白修饰外，其他几个因素也影响遗传载荷的递送，尤其是对于非病毒载体。纳米颗粒大小是一个决定因素：较大的颗粒通常比较小的颗粒摄取效率低。影响LNP或多聚复合物大小的因素包括核酸、脂质或聚合物组成、表面电荷以及靶向配体的存在与否或浓度。
内吞本身只是挑战的一部分，因为内体逃逸通常是限制步骤。在一项研究中，siRNA-LNP在30分钟内显示出在HeLa细胞中95%的摄取，但只有不到2%的siRNA到达细胞质。可电离脂质被认为在这里至关重要，因为它们在低pH下质子化，使内体膜不稳定并促进逃逸。最近的工作还表明，载荷不是被释放到细胞质中，而是可以被重新包装到细胞外囊泡中，可能介导向其他细胞的转移。
最佳基因表达——组织特异性启动子和mRNA序列优化
递送之后，基因序列必须以适当的水平表达：过度表达可能导致不良效应，而表达不足则降低疗效。启动子是蛋白质表达的关键调节因子，与目标基因一起构成表达盒的一部分。一些启动子是细胞类型特异性的，可以利用它们来改善靶向。对于离体CAR-T，最广泛使用的启动子是延伸因子1-α，它在T细胞中提供高且持久的表达。对于体内应用，启动子应最大化在靶细胞中的表达，同时最小化脱靶表达。该领域的研究仍然有限，部分原因是启动子的选择不仅影响表达特异性，还影响活性的持续时间和细胞表面的CAR密度。
对于基于mRNA的方法，非翻译区是调节蛋白质表达的。UTR序列的优化可以增强CAR表达水平，并且正在开发模型以针对不同组织类型（包括T细胞）调整UTR。另一种类型的UTR操作涉及在UTR区域之一添加位点，用于肝脏特异性miRNA（参与转录后调节）。这可以防止CAR基因在肝细胞中表达，代表了一种调节脱靶效应的方法。超越UTR区域，计算算法可用于优化RNA密码子，选择宿主细胞最有效翻译的序列。
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四、病毒与非病毒载体的生物分布和器官毒性
特异性通过确定载体的生物分布直接影响安全性。主要担忧是器官毒性，特别是在静脉内给药后。由于肝脏在血液过滤和解毒中的核心作用，载体经常在其中积累。这减少了到达靶组织的载体量，并引发了对肝毒性的严重担忧。
肝脏积累也是AdV的一个担忧。为了减轻这种影响，已经开发了称为屏蔽重新靶向腺病毒的屏蔽载体，以减少肝脏摄取和毒性。然而，这也降低了转导效率，在早期研究中，与未屏蔽的HAdV-C5相比，转导的T细胞减少了多达60%。屏蔽减少了免疫识别，这对于AdV尤其重要，因为其具有高内在免疫原性。
对于非病毒载体，据报道，30%至99%的静脉内给药的纳米颗粒会在肝脏积累。尽管如此，用于体内CAR-T治疗的LNP的近期临床前测试并未揭示任何毒性或器官损伤的迹象。然而，新兴的单颗粒和高含量成像研究表明，LNP大小、表面化学和蛋白质冠组成的微妙变化可以显著影响补体激活、库普弗细胞摄取和细胞因子释放，强调需要将详细的物理化学表征与体内免疫毒性联系起来。
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五、病毒与非病毒载体的持久性和基因插入风险
载体可根据细胞内稳定性分为两类：整合型和非整合型。这些方法对持久性和安全性都有明确的影响。整合型载体实现CAR基因永久整合到T细胞中，有可能在患者体内产生持久的CAR-T细胞。相比之下，非整合型方法将创建一个瞬时CAR-T细胞群体，一旦AAV或mRNA分子被分解，T细胞就会停止表达CAR。
考虑到安全性，非整合型方法不与靶细胞基因组相互作用这一事实是一个主要优势，基本上排除了基因插入的风险。然而，随机插入和潜在癌基因激活仍然是整合型系统的主要安全问题。广泛用于离体CAR-T疗法的LV采用“复制-粘贴”机制，其中RNA基因组被逆转录为DNA并插入宿主基因组。尽管LV优先整合到癌基因之外的区域，但突变发生的风险不能完全排除。FDA在2024年要求在所有BCMA或CD19导向的自体CAR-T产品中加入黑框警告标签，警告治疗后T细胞恶性肿瘤的风险。
为减轻这些风险，先进的LV载体已去除长末端重复序列中的增强子和启动子元件，以创建自失活载体。在离体疗法中，细胞可以在输注前进行高风险整合筛选。然而，体内应用直接在患者体内修饰细胞，因此最小化插入突变发生是必不可少的。正在研究的策略包括位点特异性整合和限制每个靶细胞的拷贝数。
与LV的“复制-粘贴”机制不同，转座子使用“剪切-粘贴”过程，其中转座酶从转座子DNA中切除基因并将其插入，通常插入基因间区域而不是基因富集区域。转座子对整合位点提供更多控制，并可能减少对关键宿主基因的破坏。例如，SB100x Sleeping Beauty转座酶显示出与逆转录病毒载体相比，随机整合模式，靶向基因和调控区域的倾向性较低，因此已被选择用于T细胞靶向DNA LNP平台，如NCtx。然而，在不同转座酶piggyBac的首次人体试验中，观察到两名患者出现CAR-T淋巴瘤。
除了LV或转座酶方法外，基于CRISPR的基因编辑正逐渐应用于基于基因组的CAR-T细胞生成。与半随机整合的LV不同，CRISPR能够在gRNA定义的位点进行靶向插入，允许对整合位点进行精确控制。T细胞受体α恒定区（TRAC）位点被认为是CAR插入的金标准。CRISPR介导的敲入的一个关键限制在于其对同源定向修复的依赖性，这发生频率较低且比非同源末端连接介导的敲除更难激活。持续改进HDR增强和递送技术将是CRISPR敲入与病毒转导效率竞争所必需的。
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六、病毒与非病毒载体的免疫原性
免疫原性是选择载体时的关键因素，考虑到与离体CAR-T和体内基因疗法相关的CRS和神经毒性风险。这种不良事件可能会超过治疗益处，或者在疗效实现之前清除治疗剂。
仅当CAR表达T细胞在体内持续存在时，CAR-T疗法才有效。理论上对于整合型载体无需重复给药。相比之下，瞬时表达的重复给药模型更适合自身免疫和心血管应用。目前，针对载体或核酸在重复给药后的免疫是一个重大挑战，特别是对于AAV和AdV。正在研究策略如蛋白酶IdeS和纳米颗粒平台ImmTOR，分别用于减少载体特异性抗体和防止中和抗体的形成。
包膜蛋白进一步影响免疫原性。非病毒载体通常表现出较低的免疫原性，从而增强了安全性并提高了重复给药的潜力。这得到了基于LNP的COVID-19疫苗安全使用的支持，尽管体内CAR-T可能需要更高剂量以引发更强反应。一种有前景的替代方案是自扩增RNA，它编码一种在细胞中扩增mRNA的复制酶。
PEG是LNP的标准成分，会触发先天免疫激活和补体反应，特别是在重复给药后。虽然这在疫苗中可能是有利的，但在CAR-T中是有问题的。缓解策略包括优化制剂以最小化免疫刺激成分，或共同递送siRNA以抑制细胞因子产生。临床阶段的LNP故意调整可电离脂质化学和颗粒稳定性，以实现“雪花状”短寿命特征，最小化全身反应原性并有利于受体介导的摄取，这种设计旨在支持慢性自身免疫适应症中的重复给药。
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七、病毒与非病毒载体的制造与成本
体内CAR-T生产不同于离体方法，它侧重于载体或载荷的制造，而不是收获、激活、基因修饰和扩增T细胞。因此，载体选择与能够满足患者需求的可扩展技术的可用性相关。体内载体的下游加工比离体使用的载体更复杂，因为残留的宿主蛋白、DNA、转染试剂和核酸内切酶必须在给药前去除。
可扩展的病毒载体生产仍然是成本降低的重大挑战，尽管正在努力提高生产率。高原材料成本，特别是GMP级pDNA和PEI，主导了支出，并存在全球性的pDNA产能短缺。纯化也由于产品损失而大大增加了成本。pDNA短缺同样影响非病毒载体。替代策略包括使用酶促过程进行合成pDNA生产。
与病毒系统相比，mRNA-LNP平台受益于基本上是序列无关的特性，加工步骤无论mRNA靶点如何都保持不变。原材料成本在所有载体类型中仍然是显著支出，约占LV总成本的40-50%，AAV的32%，以及LNP的73%。对于病毒系统，PEI和无血清培养基主导成本，而对于非病毒系统，RNA聚合酶和可电离脂质是最昂贵的组件。微流控系统现在解决了这些问题，能够实现可重复、可扩展和精确的生产。
总体而言，非病毒载体的制造成本低于病毒系统，因为LNP和多聚复合物生产通常由更可重复和可扩展的工作流程组成。它们的无细胞性质也缩短了生产时间，并允许重新利用为无菌注射剂设计的设施。尽管如此，LV、AAV和AdV的既定基础设施和生物学优势确保了病毒和非病毒载体将继续并行发展，各自适用于不同的应用。
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结语
体内CAR-T应被视为一种独特的监管和生物学模式。没有单一的载体适用于所有应用。进展将取决于将病毒和非病毒技术都调整到适应症的需求。实现这一目标需要载体工程、制造创新、分析开发和监管科学的谨慎整合。如果成功，体内免疫工程可以将CAR-T从一种定制化、受限于医院的干预措施转变为一个广泛可及、模块化的治疗类别，涵盖肿瘤学、自身免疫性疾病等领域。
On the road to in vivo CAR-T success: Comparing promising viral and non-viral vectors.
Biotechnol Adv. 2026 Sep:90:108907.
