CAR-X细胞工程学

-01-

引言

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已彻底改变了血液恶性肿瘤的治疗，并持续改变着多种其他疾病的治疗格局。然而，当前的CAR-T细胞疗法存在一些限制其疗效并阻碍其更广泛应用的因素，其中部分可归因于T细胞的内在特性。因此，使用常规T细胞之外的免疫细胞已成为一种有前景的策略，以弥补这些局限性。

-02-

一、CAR-X细胞的免疫生物学

不同的免疫细胞平台拥有不同的效应功能和识别机制，可以通过CAR工程加以利用，以扩大治疗范围并解决限制CAR-Tconv细胞疗法的障碍。

NK细胞

NK细胞是先天免疫反应的关键组成部分，能够无需预先致敏即可快速响应病原细胞。大多数循环NK细胞为CD16⁺CD56⁻dim表型，具有强大的杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的能力。这种细胞毒性由多种机制介导，主要包括释放各种细胞因子、产生细胞毒颗粒（穿孔素和颗粒酶）以及结合死亡受体如Fas配体（FasL）和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）。与具有效应表型的T细胞相比，NK细胞释放的促炎细胞因子较少，因此诱发炎症副作用（如细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征）的风险较低。它们较短的寿命也降低了持续激活或过度细胞毒性的风险，但这对过继性转移治疗构成了挑战。这些细胞毒性机制，结合有利的安全性特征，使NK细胞成为CAR工程的一个强大而多功能的平台。

NK细胞的激活由激活信号和抑制信号共同介导。NK激活受体（如NKG2D、NKp46和CD16a）触发对表达应激诱导配体（如MICA和MICB）的细胞的细胞毒性。相比之下，NK细胞上的抑制性受体（如KIR和NKG2A）与健康细胞上的MHC-I分子结合，识别“自我”信号并抑制NK细胞激活。这个过程使NK细胞能够检测到MHC-I缺失或下调的肿瘤细胞，这是一些实体瘤常用的免疫逃逸策略。通过CD16a，NK细胞还能识别IgG包被的病原细胞并介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC），有助于抗体依赖性清除。这些识别机制赋予了NK细胞强大而广泛的靶向能力，使其适用于抗原异质或MHC-I表达下调的肿瘤的细胞免疫治疗。

尽管具有固有的细胞毒性和有利的安全性特征，NK细胞的体内功能持久性有限（在没有外源性细胞因子支持的情况下大约1-2周），且抗原驱动的克隆扩增潜力有限，从而限制了持续的肿瘤杀伤活性。与Tconv细胞相比，NK细胞拥有先天抗病毒防御机制，导致病毒载体的转导效率较低。此外，NK细胞也容易受到TME内免疫抑制信号的影响。

巨噬细胞

巨噬细胞是先天免疫系统不可或缺的组成部分，通过吞噬病原体和细胞碎片、分泌促炎细胞因子和趋化因子、以及呈递抗原激活适应性免疫来维持免疫稳态。巨噬细胞对肿瘤来源的趋化因子表现出高趋化性，并能产生基质金属蛋白酶（MMPs）（特别是MMP9和MMP12），这些酶可以降解细胞外基质（ECM）成分，从而促进强大的肿瘤浸润。抗肿瘤巨噬细胞大多采用M1极化表型，可由干扰素-γ（IFNγ）或细菌脂多糖诱导。M1极化巨噬细胞执行效应功能，包括吞噬作用、产生细胞毒性活性氧和氮物种、以及分泌促炎细胞因子（例如，IL-1β、IL-6、TNF和IL-12）。这种促炎细胞因子和趋化因子的释放在驱动全身性炎症和招募细胞毒性T细胞和NK细胞方面起着关键作用，进一步扩大针对病理损伤的免疫激活。

相比之下，由抗炎信号（如IL-4和TGFβ）诱导的M2巨噬细胞促进组织修复，但也促进肿瘤进展。在TME内，缺氧和免疫抑制因子（如TGFβ）使肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）偏向M2样表型，后者介导免疫抑制，分泌促血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF），并通过MMP2和MMP9重塑ECM。ECM重塑过程促进肿瘤侵袭、转移以及免疫抑制微环境的形成。因此，尽管M1巨噬细胞的效应功能为实体瘤治疗提供了有前景的潜力，但其功能可塑性是巨噬细胞免疫治疗临床转化的主要挑战。

Treg细胞

Treg细胞是CD4⁺ T细胞的一个特殊亚型，介导免疫耐受和稳态。Treg细胞的TCR特异性识别自身肽和MHC分子，使Treg细胞能够调节抗原呈递细胞（APCs）和效应淋巴细胞的活动。Treg细胞的免疫抑制表型由FOXP3为中心的转录网络和独特的Treg细胞特异性表观遗传景观共同协调。

FOXP3介导的特征基因表达是Treg细胞主要抑制机制的基础。CD25（IL-2受体的α链，由IL2RA编码）的组成性高表达使Treg细胞能够消耗可溶性IL-2，从而限制其对效应T细胞的可用性。这种IL-2剥夺抑制了效应T细胞的激活和增殖。同时，Treg细胞上的CTLA4与APCs上的CD80和CD86结合，竞争性地减少它们与效应T细胞上共刺激受体CD28的结合。IL-2剥夺和共刺激阻断的结合驱动效应T细胞走向功能失能甚至凋亡。

除了接触依赖性抑制外，Treg细胞还分泌免疫调节细胞因子（主要是TGFβ和IL-10）以抑制效应T细胞和APCs的活化、细胞因子产生和增殖。Treg细胞可以感知过度炎症下的代谢变化；例如，FOXP3促进CD39和CD73的表达，这两种表面外切核苷酸酶可将细胞外ATP水解为腺苷，腺苷可在靶细胞中诱导细胞内抑制信号通路。在过度炎症条件下，CD39和CD73检测到过度活化的免疫细胞释放的细胞外ATP增加，并产生腺苷以抑制其活性。

总的来说，Treg细胞拥有独特的免疫抑制功能，因此适用于治疗以过度激活的免疫反应为特征的疾病，如自身免疫性疾病和移植物抗宿主病（GvHD）。然而，天然Treg细胞仅占循环CD4⁺ T细胞的大约5%，这对大规模扩增和过继性转移构成了实际限制。将内在的免疫抑制能力与CAR介导的抗原识别相结合，同时配合定制的扩增和工程策略，可能会增强靶向特异性，改善功能稳定性，并防止不必要的泛免疫抑制。

非常规T细胞

非常规T细胞，包括NKT细胞、γδ T细胞和黏膜相关恒定T（MAIT）细胞，是不同于CD4⁺和CD8⁺ αβ T细胞的特殊T细胞亚群，在抗原识别和功能特性上均有所不同。与Tconv细胞不同，非常规T细胞通过非多态性抗原呈递分子或MHC非依赖性机制识别非肽抗原。因此，非常规T细胞在过继性转移期间诱发GvHD的风险较低，因此有望用于“即用型”同种异体细胞产品。此外，这些细胞可以介导靶向细胞毒性，表现出独特的组织趋向性，并桥接先天性和适应性免疫反应。非常规T细胞仅占循环T细胞的大约10%，其低丰度导致它们在传统细胞免疫治疗中较少被探索。尽管如此，它们的独特特征可能有助于克服CAR-Tconv细胞的某些局限性，如抗原逃逸和TME抑制。

NKT细胞：NKT细胞是T细胞的一个独特亚群，结合了T细胞和NK细胞的细胞毒性机制和靶标识别能力。恒定NKT（iNKT）细胞是主要的NKT细胞亚群。它们通过半不变TCR识别由非多态性CD1d分子呈递的甘油脂抗原，该TCR由保守的α链与受限的β链库配对组成，这与Tconv细胞形成对比，后者表达通过广泛V（D）J重组产生的、高度多样化的TCRs。值得注意的是，iNKT细胞在恶劣的TME中表现出显著的适应性；它们可以靶向免疫抑制区室（如TAMs和髓源性抑制细胞），这些细胞通常在其表面表达CD1d。通过细胞毒颗粒释放、死亡受体结合和细胞因子分泌，iNKT细胞可以清除这些表达CD1d的抑制性区室。此外，iNKT细胞对肿瘤来源的趋化因子（包括CCL2和CCL20）表现出强烈的趋化反应，从而促进有效的肿瘤归巢。在一项直接比较NK细胞和iNKT细胞的临床前小鼠模型中，在晚期乳腺癌的TME中观察到了不同的功能状态。NK细胞表现出衰老特征。相比之下，iNKT细胞保持了过度激活的表型，并保留了效应功能。这种激活状态的特征是耗竭相关抑制性受体（包括CTL4A、TIM3和PD1）的表达减少，同时激活和细胞毒性分子（如颗粒酶B、NKG2D和IFNγ）的表达增加。这些特征支持了iNKT细胞浸润实体瘤并在免疫抑制性TME内维持功能的能力。

γδ T细胞：γδ T细胞以其TCRs为特征，该TCR由γ链和δ链组成，而不是Tconv细胞中的α链和β链。虽然它们仅占循环T细胞的大约4%（0.5-16%），γδ T细胞与αβ T细胞一起在抗肿瘤中起着关键且不可替代的作用。根据可变δ链（Vδ）的组成，γδ T细胞分为Vδ1、Vδ2、Vδ3和Vδ5。其中，Vδ2是主要群体（占γδ T细胞的60-95%），而Vδ1细胞最多占三分之一。Vδ2细胞大多在周围血中循环并表现出细胞毒活性，而Vδ1细胞优先存在于黏膜组织中。在TCR结合后，γδ T细胞分泌I型细胞因子（包括TNF和IFNγ），产生细胞毒颗粒，并介导死亡受体结合。它们还可以作为APCs将肿瘤抗原交叉呈递给αβ T细胞，从而放大抗肿瘤反应。由于其强大的细胞毒性，Vδ2细胞一直是γδ T细胞免疫治疗各种实体瘤的焦点。Vδ1细胞也因其记忆样表型、对激活诱导凋亡的抵抗性以及向实体瘤的浸润而受到关注。肿瘤浸润Vδ1细胞的存在与良好的患者预后相关，表明其治疗价值。此外，γδ T细胞也表达NK激活受体（例如，NKG2D和NKp33）以发挥不依赖于TCR的细胞毒性。例如，Vδ2细胞具有高水平的CD16，可以识别抗体的Fc区以介导ADCC。

MAIT细胞：MAIT细胞优先聚集在黏膜组织中，并表达半不变TCR α链（Vα7.2-Jα33）。MAIT细胞平均占总T细胞的3.1%（0.1-9.2%）。它们的TCR特异性识别由MHC I类相关蛋白1（MR1）呈递的微生物衍生代谢物，MR1是一种在骨髓来源的APCs和一些上皮细胞上高表达的非多态性分子。值得注意的是，M2极化的TAMs可以表现出MR1表达升高，使得MR1高表达的巨噬细胞更容易受到MAIT细胞介导的靶向，这可能有助于MAIT细胞适应免疫抑制性TME。MR1限制性激活通过释放效应分子（如颗粒酶）和促炎细胞因子（包括IFNγ、TNF和IL-17）触发MAIT细胞强大的细胞毒性。组织驻留MAIT细胞分泌的IL-17促进中性粒细胞招募，激活的MAIT细胞可以通过上调CD40L与树突状细胞相互作用，从而反式激活其他免疫细胞。与其他两种非常规T细胞类似，MAIT细胞也表达几种NK细胞激活受体（如NKG2D、NKp40和NKp33），使其能够不依赖于MR1而激活，从而拓宽其肿瘤靶向能力。重要的是，MAIT细胞上的MR1限制性和半不变TCR在同种异体骨髓移植过程中不介导同种异体反应，表明其具有用于“即用型”细胞产品的潜力。

总的来说，这些非常规T细胞表现出独特的免疫属性，包括特殊的靶标谱、组织趋向性和对恶劣TME的适应性，这可以弥补CAR-Tconv细胞疗法面临的挑战。

-03-

二、CAR-X细胞的制造与工程

CAR-NK细胞

NK细胞可以从患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中获取，并使用添加了细胞因子（主要是IL-2）的培养基和经辐照的饲养细胞进行扩增。然而，循环NK细胞的低丰度（约占循环淋巴细胞的10%）、功能持久性短（通常1-2周）以及对基因修饰的抵抗性限制了PBMCs来源NK细胞的效率。因此，大多数临床前和临床研究倾向于使用非自体来源来开发CAR-NK细胞，包括NK-92细胞系、脐带血（UCB）、诱导多能干细胞（iPS细胞）、CD34⁺造血祖细胞和人胚胎干细胞。其中，UCB来源的NK细胞是临床研究中最广泛使用的来源（NCT00900809、NCT03056339和NCT05008575；）。

临床UCB通常从冷冻保存的脐带血单位中获得，进一步通过CD3、CD19和CD14阴性选择进行纯化以分选出NK细胞。外源性IL-2、饲养细胞膜结合IL-21和4-1BB配体对于UCB来源CAR-NK细胞的体外维持至关重要。人诱导多能干细胞是另一个重要来源，可以使用饲养细胞支持培养和逐步细胞因子驱动条件分化为功能性NK细胞，这些条件促进造血定向和NK细胞成熟。这些诱导的NK细胞来源受到青睐，因为它们同种异体反应风险较低，易于进行基因修饰，并且可以在体外大规模扩增，使其对“即用型”产品开发具有吸引力。

对于CAR转导，逆转录病毒载体仍然是主要方法，效率为22.7-91.1%（中位数约60%）。非病毒方法，如电穿孔和脂质纳米颗粒（LNPs），已被探索，但到目前为止尚未达到病毒系统的效率。

CAR-NK细胞中的CAR结构与CAR-T细胞中的主要区别在于共刺激域的选择。在CAR-T细胞设计中，CD28共刺激通常与更强的细胞毒性相关，但也与快速耗竭相关，而4-1BB共刺激则促进持久的抗肿瘤反应并支持记忆表型。相比之下，在CAR-NK细胞中，CD28共刺激可以在体外和小鼠模型中产生强大的抗肿瘤活性，其持久性和肿瘤浸润能力与4-1BB共刺激相当。机制研究表明，CAR-NK细胞中的CD28信号传导招募各种关键激酶，主要是淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）和ζ链相关蛋白激酶70（ZAP70），这可能增强CAR-NK细胞功能并减轻基础信号传导。尽管如此，尚无确切的临床证据来确定在CAR-NK细胞背景下CD28还是4-1BB更优越，因为两者都经常被应用。

其他策略包括将NK细胞特异性信号分子整合到CAR结构中，以利用天然的NK细胞信号通路。此类分子包括NKG2D、LFA-1、2B4、DAP10和4-1BB。

CAR-巨噬细胞

PBMCs来源的单核细胞仍然是人源化模型中CAR-巨噬细胞研究的主要来源，而THP-1单核细胞系在临床前研究中常被用作替代物。在临床研究中，单核细胞先用G-CSF从外周血中动员，然后通过单采术获得，随后通过补充GM-CSF分化为巨噬细胞（NCT06562647和NCT04660929）。

工程化的CAR-巨噬细胞被保存在含有关键细胞因子的培养基中，主要是M-CSF和GM-CSF，这些因子支持谱系规范和功能成熟。除了PBMCs中的单核细胞外，iPS细胞是治疗性CAR-巨噬细胞的另一个重要来源，因为其具有卓越的基因可操作性和可扩展性。生成iPS细胞来源CAR-巨噬细胞的主要挑战在于精确地将iPS细胞定向分化为巨噬细胞。一个逐步分化方案使用连续暴露于细胞因子，包括bFGF、VEGF、SCF、IGF1、IL-3、M-CSF和GM-CSF。在最终分化阶段去除IL-3使M-CSF和GM-CSF能够驱动终末分化和功能极化，产生具有一致表型和效应功能的CARa-巨噬细胞。

病毒转导是向巨噬细胞递送CAR基因的主要策略；例如，Ad5F35腺病毒系统实现了平均79.28%的稳健CAR转导效率、86.39%的细胞活力和86.78%的纯度（NCT04660929）。慢病毒载体也已用于转导CAR-巨噬细胞；可以通过优化感染条件来提高转导效率，包括去除聚凝胶、将病毒暴露时间延长至过夜孵育、掺入密码子优化的VSV-G包膜，以及将感染延迟至单核细胞分离后7天。

尽管如此，由于巨噬细胞具有独特的核酸传感通路，会触发抗病毒防御并限制基因转移效率，非病毒递送策略正受到越来越多的关注。例如，已经探索使用LNPs将CAR mRNA递送到巨噬细胞中并实现原位编程。有趣的是，由于巨噬细胞具有天然的吞噬能力，它们能非常有效地内化纳米颗粒（如LNPs），这使得巨噬细胞非常适合进行体内CAR工程。此外，丰富的肿瘤驻留TAMs可以通过体内CAR工程（例如DNA纳米载体）重编程为M1极化表型，从而实现局部区域抗肿瘤效应并降低全身性炎症的风险。

早期的临床前CAR-巨噬细胞设计整合了巨噬细胞特异性信号分子的胞内结构域，例如Megf10和FcRγ以驱动吞噬作用，以及CD147以促进MMP产生。这种策略后来通过整合来自模式识别受体和其他巨噬细胞相关受体的结构域而得到扩展。例如，FcγR1（天然介导巨噬细胞中的细胞因子释放和抗体依赖性细胞吞噬作用）已被整合到CAR结构中，在体内显示出良好的抗肿瘤功效和吞噬活性。其他功能受体，如MerTK、Megf10和FcRγ，同样增强了抗原依赖性吞噬作用，改善了抗原呈递，并在多种实体瘤模型中减轻了肿瘤负荷。然而，这些CAR结构也引发了关于巨噬细胞介导的全身性炎症的安全性问题，因此尚未进行进一步的临床评估。相比之下，经典的CD3ζ-CAR结构具有明确的安全性特征。尽管CD3ζ在天然巨噬细胞中通常不表达，但CD3ζ-CAR可以在体外促进CAR-巨噬细胞的吞噬作用和细胞因子产生，并在卵巢癌和表达GD2的神经母细胞瘤小鼠模型中显著减轻肿瘤负荷且副作用可耐受。这一结果可能是由于CD3ζ和FcRγ之间的结构同源性。这种功能稳健性使CD3ζ-CAR成为第一个进入临床试验的CAR-巨噬细胞设计（NCT04660929；）。

CAR-巨噬细胞的一个关键功能考虑是促进和维持输注后的M1样表型。将CD3ζ与来自TLR4的TIR结构域串联融合可增加NF-κB核转位并维持促炎细胞因子表达，这些都是M1样极化的强烈迹象。但与M1极化相关的强效促炎细胞因子产生和效应功能引发了关于全身性炎症副作用的潜在担忧。在临床应用之前，需要进一步的改进以提高功能性和安全性。

CAR-Treg细胞

在当前的CAR-Treg细胞研究中，从CD4⁺富集的PBMCs中分选出的CD4⁺CD25highCD127⁺天然Treg（nTreg）细胞因其功能稳定性而受到青睐。CAR结构通常通过逆转录病毒载体递送到nTreg细胞中，随后用抗CD3/CD28磁珠刺激以诱导激活和扩增。工程化的CAR-Treg细胞然后在补充有重组IL-2的X-VIVO15培养基中培养，IL-2对其存活和维持FOXP3表达至关重要。为了进一步维持FOXP3依赖性免疫抑制表型的稳定性并有选择地限制效应Tconv细胞的增殖，通常将mTOR抑制剂（如雷帕霉素或依维莫司）与IL-2一起加入培养基中。尽管这些基于nTreg的方案使得在临床前CAR-Treg细胞研究中能够在体外生成CAR-Treg细胞，但nTreg细胞固有的低丰度（约占循环CD4⁺ T细胞的5%）仍然是临床转化的一个关键限制。

相比之下，诱导性Treg（iTreg）细胞是通过转化CD4⁺ Tconv细胞产生的，与nTreg细胞相比，提供了更具可扩展性的来源。iTreg细胞在当前的CAR-Treg细胞研究中较少受到重视，因为产生具有稳定体内免疫抑制表型的iTreg细胞存在技术障碍。iTreg细胞容易丢失FOXP3表达并获得效应T细胞表型，特别是在炎症条件下。CAR-iTreg细胞是通过同时将外源性FOXP3和CAR基因导入CD4⁺ Tconv细胞中产生的，但功能评估主要局限于体外分析。尽管未评估体内谱系稳定性，但适度的体内结果可能反映了这些CAR-iTreg细胞的不稳定性。沿着这些思路，仅诱导FOXP3不足以在特征基因位点建立Treg细胞特异性DNA低甲基化，这对于稳定的Treg细胞表型至关重要。因此，确保FOXP3表达和Treg细胞特异性表观遗传景观对于生成功能稳定且临床可扩展的CAR-iTreg细胞至关重要。

例如，为了更有效地诱导FOXP3，可以在IL-2之外联合添加TGFβ和细胞周期蛋白依赖性激酶8（CDK8）和CDK19抑制剂，因为它们不仅可以诱导FOXP3表达，还可以限制效应T细胞分化。此外，在体外转化过程中剥夺CD28共刺激信号可以促进在Treg细胞特征基因增强子区域建立Treg细胞特异性DNA低甲基化，该过程不依赖于FOXP3。将这些策略相结合，可以在炎症性肠病和GvHD的小鼠模型中产生稳定且功能性的iTreg细胞，并具有抑制效力。将这种稳定且功能性iTreg细胞策略与CAR工程相结合，是开发具有增强谱系稳定性、抑制效力和转化可扩展性的CAR-Treg细胞的一个有前景的方向。

CAR-Treg细胞中的CAR结构尚未整合许多新的或定制的设计，大多采用第二代CAR结构。然而，与Tconv细胞相比，CAR-Treg细胞对共刺激域表现出不同的偏好。在一项对十种整合了不同共刺激域的CAR-Treg细胞构建体进行的体内比较评估中，野生型CD28设计显示出优于所有其他构建体（包括那些含有4-1BB的构建体）的抑制功能。在自身免疫性疾病和GvHD模型中的其他体内研究也证实，与4-1BB相比，CD28共刺激显著增强了功能稳定性和治疗功效。这种差异反映了Treg细胞独特的免疫生物学特性；CD28信号传导对于维持Treg细胞增殖和CTLA4表达至关重要。相比之下，CAR-Treg细胞中的4-1BB共刺激容易引发基础激活，从而降低谱系稳定性。在体外扩增期间，短暂暴露于mTOR抑制剂和维生素C可以减轻4-1BB CAR-Treg细胞中基础信号传导诱导的功能障碍，这可能是由于特征基因位点的表观遗传修饰。尽管如此，对于CAR-Treg细胞而言，CD28仍然是最功能稳定的共刺激域。

非常规CAR-T细胞

临床iNKT细胞是从自体PBMCs中提取的，使用靶向恒定TCR α链Vα24-Jα18的特异性微珠。分离的iNKT细胞使用依赖于饲养细胞的系统进行刺激和培养，该系统以α-半乳糖神经酰胺（αGC）脉冲的PBMCs为特征。αGC是一种合成的甘油脂抗原，可以被PBMCs中APCs上的CD1d呈递；因此，αGC脉冲的PBMCs可以刺激iNKT细胞的激活和扩增。此外，αGC脉冲的人工APCs（aAPCs）结合IL-2能够产生临床规模的CAR-iNKT细胞剂量（每次输注≥1 × 10⁷个细胞）。在体外扩增期间补充重组IL-2和IL-21进一步增强了CD62L⁺ iNKT细胞的富集，将其丰度在初次扩增后增加到80.4%，而单独使用IL-2时为56.9%。这些扩增的CAR-iNKT细胞在体外和淋巴瘤小鼠模型中表现出抗肿瘤活性。尽管这种PBMCs来源、依赖饲养细胞的方案效率很高，但iNKT细胞仅占循环T细胞的0.01-0.1%，这对可扩展的临床应用构成了挑战。

使用可扩展的同种异体来源开发“即用型”CAR-iNKT细胞是一个有前景的替代方案。来自脐带血来源的造血干细胞可以被引导分化为各种类型的免疫细胞，包括iNKT细胞。为了生成脐带血来源的同种异体CAR-iNKT细胞，CD34⁺ HSCs通过CAR慢病毒和CRISPR-Cas9（B2M-CIITA引导RNA）进行共编辑。B2M和CIITA引导RNA引导敲除人类白细胞抗原I类（HLA-I）和HLA-II分子，从而产生HLA⁻ CAR-HSCs。然后，通过一个逐步程序将同种异体CAR-HSCs分化为成熟的同种异体CAR-iNKT细胞，该程序包括淋巴祖细胞扩增和成熟补充物、CD3–CD28–CD2 T细胞激活剂和IL-15。对于体外扩增，有多种方法可用，效率相当，包括αCD3和αCD28扩增、αGC和PBMC扩增以及人工APC扩增。该方案可以从5 × 10⁶个CD34⁺ HSCs中产生1 × 10¹²个同种异体CAR-iNKT细胞，显示出巨大的临床可扩展应用潜力。

CAR-γδT细胞的制造需要有效的谱系富集和体外扩增，但目前对于Vδ2或Vδ1细胞都没有被广泛接受或稳健的方案。Vδ2细胞最初在过继性转移研究中受到更多关注，因为与Vδ1细胞相比，其外周丰度更高，细胞毒性潜力更强。Vδ2细胞的体外激活和扩增利用了它们对异戊烯焦磷酸的识别，异戊烯焦磷酸通过哺乳动物细胞中的甲羟戊酸途径产生。用唑来膦酸处理分选的PBMCs会破坏APCs中的甲羟戊酸途径，导致异戊烯焦磷酸积累，从而选择性地激活和富集Vδ2细胞。分离和病毒转导后，需要补充细胞因子（IL-2、IL-15和IL-21）和aAPCs以支持体外扩增并维持CAR-Vδ2细胞的体内细胞毒性。然而，用这些方法生成的CAR-Vδ2细胞在持续的肿瘤抗原刺激下会迅速失去细胞毒性，并需要额外的IL-2给药。

Vδ1细胞因其记忆样表型、对激活诱导凋亡的抵抗性以及向实体瘤的浸润而在CAR工程中引起兴趣。开发了一种临床级Vδ1细胞扩增和分化方案，涉及细胞因子混合物（如IL-15、IL-2和IFNγ）以及通过OKT3抗体进行的TCR刺激。在CAR背景下，当前的CAR-Vδ1细胞研究大多采用基于抗体的富集策略，使用与CAR-Vδ2细胞类似的细胞因子混合物（可溶性IL-2、IL-15和IL-21）和aAPCs来生成和扩增Vδ1细胞。T细胞丝裂原刀豆素A（ConA）选择性地扩增来自PBMCs的Vδ1细胞，但总体产量和基因修饰效率仍然有限。ConA激活的Vδ1细胞表现出较低的CAR转导效率（约20-40%），而CD3激活和CD28激活的αβ T细胞的平均转导效率为61.57%。此外，即使在扩增后，αβ T细胞仍然是培养物中的主要群体，从而限制了临床上足够的CAR-Vδ1细胞产品的生成。仍然需要一个稳健有效的体外扩增方案。

鉴于CAR-MAIT细胞或MAIT细胞过继性转移研究的稀缺性，目前仍缺乏一个稳健的体外CAR-MAIT细胞制造方案。MAIT细胞可以通过靶向TCR Vα7.2从PBMCs中分离出来，并用表达CAR的慢病毒载体转导，然后在含有细胞因子混合物（包括IL-2、IL-7和IL-15）的培养基中体外扩增。

目前大多数非常规CAR-T细胞研究都采用了常规CAR的CAR结构，定制的CAR设计很少。探索性努力已经整合了细胞因子共表达以增强持久性和细胞毒性功能；例如，在CAR-iNKT细胞中包含IL-15改善了功能，在体内外产生了持久的持久性且无明显毒性。共表达IL-12可以进一步增加CD62L⁺ CAR-iNKT细胞中CD62L的表达，诱导持久的记忆表型，并维持体内抗肿瘤反应。在CAR-Vδ1T细胞中，共表达IL-2增强了体外细胞毒性，并放大了细胞因子（包括TNF和IFNγ）的分泌。除了细胞因子共表达外，整合双特异性T细胞衔接器（BiTE）分泌等策略也在非常规CAR-T细胞中进行了探索。例如，靶向HLA-G的CAR-γδT细胞分泌PDL1–CD3ε BiTE，抵消了原发性肿瘤细胞上PDL1的上调，并在体内外增强了细胞毒性反应。

总的来说，当前非常规CAR-T细胞的设计大多依赖于来自CAR-Tconv细胞的既定CAR结构。定义非常规CAR-T细胞的功能免疫生物学对于指导定制的CAR结构设计至关重要。

-04-

三、CAR-X细胞的治疗应用

CAR-NK细胞

NK细胞是基于CAR免疫疗法中研究第二广泛的免疫细胞平台，被广泛认为是CAR-Tconv细胞的有前景的替代方案，因为它们可以减轻CRS和GvHD等并发症。CAR-NK细胞的治疗潜力已在多种肿瘤中得到探索，多项临床试验显示出有前景的疗效、潜在挑战和安全性特征。

初步的CAR-NK细胞研究主要靶向CD19，这是一个针对B细胞谱系血液恶性肿瘤经过广泛验证的靶点。将IL-15和iC9自杀基因整合到CAR-NK细胞中，在37名B细胞恶性肿瘤患者中，实现了1年总生存率68%和无进展生存率32%（NCT03056339；）。值得注意的是，这些患者中有31人至少接受过三线治疗但仍复发，这突显了该方法相对于标准治疗的疗效。类似地，iPS细胞来源的CAR-NK细胞在86名B细胞淋巴瘤患者中显示出良好的安全性和初步活性，该设计整合了Fc受体CD16与抗CD19-CAR结合，以增强NK细胞的ADCC。这种方法在所有患者中实现了11.6%的CRS发生率，同时客观缓解率为54.4%，中位缓解持续时间为16.9个月（NCT04245722；）。CAR-NK细胞也已针对其他B细胞抗原开发，包括CD20和FLT3，在临床前模型中显示出积极的抗肿瘤活性。例如，双功能CAR-NK细胞通过双重识别CD20和NKG2D在体外杀死了CD20⁺肿瘤细胞。类似地，FLT3-CAR-NK细胞在体外对FLT3⁺ B细胞急性淋巴细胞白血病细胞表现出细胞毒性，并在异种移植小鼠模型中抑制了B细胞急性淋巴细胞白血病进展，且安全性可控。

CAR-NK细胞也正在被研究用于一系列实体瘤，靶向几种已确立的标志物。在各种实体瘤中，表面应激诱导配体上调很常见，这些配体可以被NK细胞激活受体NKG2D识别。用NKG2D胞外域替换常规CAR结构中的单链可变片段（scFv）域，使CAR-NK细胞能够特异性靶向患者肝脏中的转移性结直肠肿瘤（NCT03415100）。人表皮生长因子受体2（HER2）是在各种实体瘤中表达的经典标志物，一直是CAR-NK细胞实体瘤研究的主要焦点。一项涉及9名HER2⁺胶质母细胞瘤患者颅内注射抗HER2-CAR-NK细胞的I期临床试验报告了中位总生存期为31周，尽管该治疗对疾病进展影响有限（NCT03383978）。此外，其他靶点，如EGFR、B7-H6和间皮素，也显示出临床前潜力。

CAR-巨噬细胞

巨噬细胞卓越的肿瘤浸润和吞噬能力使CAR-巨噬细胞成为治疗实体瘤的有希望的候选者，而实体瘤通常对CAR-Tconv细胞疗法无效。目前，CAR-巨噬细胞研究大多处于临床前阶段，旨在实现稳定的M1极化。

首份关于CAR-巨噬细胞应用于患者的报告涉及用抗间皮素-CAR-巨噬细胞（SY001，NCT06562647）治疗两名晚期卵巢癌患者。该CAR-巨噬细胞产品在卵巢癌异种移植小鼠模型中诱导了近乎完全的肿瘤消退。然而，接受治疗的两名患者在28天的随访期内仅病情稳定，没有明确的治疗获益。最近的一项临床试验用CD3ζ基抗HER2-CAR-巨噬细胞治疗了14名HER2⁺实体瘤患者（NCT04660929）。输注的CAR-巨噬细胞迁移到实体瘤TME中并交叉激活CD8⁺ T细胞。然而，治疗效果有限，因为只有44%的HER2 3+（HER2高表达水平）肿瘤患者在8周时病情稳定，在HER2 2+肿瘤患者中没有观察到有意义的活性。中位无进展生存期仅为1.47个月。所有患者都出现了不同的治疗相关不良事件，64%（9/14）的患者出现1级和2级CRS，所有症状均在1-4天内缓解。这些结果表明，将CAR-巨噬细胞应用于实体瘤患者在技术上是可行的，但当前设计的治疗效果有限。

CAR-Treg细胞

多克隆Treg细胞的过继性转移在一系列临床前和临床研究中，对于以过度免疫活性为特征的疾病（如1型糖尿病和GvHD）具有治疗效果。然而，对脱靶过度免疫抑制和潜在促肿瘤作用的担忧限制了进一步的临床探索。CAR的整合可以提供抗原特异性靶向，从而提高安全性并减少治疗所需的细胞剂量，从而解决了关键的转化挑战。

CAR-Treg细胞在GvHD和移植排斥等疾病中展现出巨大前景。在造血干细胞移植后的GvHD中，HLA不匹配，特别是HLA-A2，在触发免疫同种异体反应中起关键作用。HLA-A2由各种细胞（包括APCs）表达；因此，靶向HLA-A2的CAR-Treg细胞（A2-CAR-Treg细胞）可以抑制APCs向来自供体的同种异体反应性T细胞呈递抗原，从而预防小鼠的异种GvHD。在非人灵长类动物中，A2-CAR-Treg细胞迁移到移植部位并持续进行局部免疫抑制。此外，A2-CAR-Treg细胞抑制了HLA诱导的皮肤移植免疫排斥，在小鼠中保持了皮肤完整性并改善了移植结果。这些有前景的结果推动了两项正在进行的A2-CAR-Treg细胞预防移植排斥的临床试验（NCT04817774和NCT05234190）。

非常规CAR-T细胞

工程化非常规CAR-T细胞方法在很大程度上是探索性的，旨在利用其细胞毒性潜力、更广泛的靶标识别能力和降低的MHC依赖性。然而，这些研究大多只是将CAR结构和设计策略从CAR-Tconv细胞移植到非常规T细胞上，并且主要侧重于评估细胞毒性功效。尽管如此，大多数这些策略忽略了非常规T细胞的独特功能特性和组织趋向性。进一步的研究应超越直接适应，探索针对这些细胞内在生物学特性定制的CAR设计。对其在TME中的激活、持久性和功能的更深入的机制理解对于优化其临床应用至关重要。

CAR-iNKT细胞已在临床前模型中针对实体瘤进行开发。靶向GD2（在神经母细胞瘤细胞上高表达的标志物）的CAR-iNKT细胞表现出位点特异性迁移、肿瘤浸润和抗肿瘤活性。目前，有一项已发表的针对神经母细胞瘤患者的I期临床试验靶向GD2。观察到了足够的体内扩增和肿瘤迁移：每次输注产品平均产生4.5 × 10⁸（范围2.9 × 10⁸ – 9.1 × 10⁸）个CAR-NKT细胞，并且外周血中CAR-NKT细胞的丰度与其在肿瘤组织中的积累呈正相关。然而，初步临床结果并不理想，客观缓解率仅为25%（3/12），且只有一例完全缓解（NCT0329454）。

第一个CAR-γδ T细胞研究于2004年进行，它用靶向CD19或GD2的第一代CAR转导了Vδ2细胞。后来的一项研究将第二代抗CD19-CAR引入γδ T（包括Vδ1和Vδ2）细胞，表明CAR-γδ T细胞可以在CD19⁺ aAPCs上扩增。为了改善归巢，一种方法是用NKG2D的外部部分替换CAR的scFv域，使其能够识别肿瘤相关的NKG2D配体。NKG2D-CAR-Vδ2细胞在卵巢癌小鼠模型中延长了生存期，并且已经进行了一项临床试验，以验证其在复发和/或难治性转移性实体瘤患者中的治疗效果（NCT04107142）。另一种策略是整合PDL1–CD3ε BiTE。该BiTE结合肿瘤细胞上的PDL1和旁观者T细胞上的CD3ε，促进CAR-γδ T细胞浸润，并通过招募的T细胞放大细胞毒性效应。该策略由在TME内分泌的抗HLA-G-CAR-γδ T细胞工程化，在小鼠中减少了肿瘤负荷并改善了生存期，从而引发了一项评估其治疗潜力的临床试验（NCT06150885）。