引言
自2000年首个ADC Mylotarg®获批以来，ADC领域取得了显著进展，截至2025年，全球已有16款ADC获批，超过300款处于临床开发阶段。早期ADC受限于使用不稳定的连接子（如酸可裂解的腙键连接子）和随机的赖氨酸或半胱氨酸偶联，通常导致次优的稳定性和安全性特征。后续几代ADC纳入了更稳健的连接子和位点特异性偶联策略，改善了治疗指数并降低了脱靶毒性。
ADC制剂开发应解决通常因将抗体与连接子和载荷偶联而引入的不稳定性，如连接子断裂或聚集增加。此外，由外部因素（如储存温度、机械应力、光照和氧化应激）引起的物理和化学不稳定性也可能进一步损害ADC的稳定性，这些应在制剂和工艺开发中得到解决。连接子不稳定引起的化学问题可能导致载荷过早、非特异性的释放，使得强效细胞毒性载荷暴露于健康组织，引起系统性副作用。因此，为降低其中一些稳定性风险，大多数已上市的ADC以冻干粉末形式供应，以增强制剂的保质期并最大限度地减少降解。然而，冻干本身也引入了复杂性，需要仔细优化辅料、循环参数和复溶稳定性。此外，在放大和灌装操作过程中ADC稳定性可能受到进一步影响，因此必须实施量身定制的工艺开发步骤和明确定义的控制策略，以确保产品完整性和一致性。
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一、影响ADC稳定性的因素
ADC的稳定性本质上比抗体稳定性更复杂，因为整合的连接子-载荷部分引入了额外的化学问题，并扰乱了抗体的物理化学性质。通常疏水性载荷的偶联会改变表面电荷、疏水性以及胶体和构象性质，导致溶解度降低、聚集增加，并影响药代动力学。此外，连接子-载荷本身在应激条件下容易发生化学降解。因此，ADC稳定性应被视为整个偶联物的一个综合属性，而非其各个组成部分——抗体、连接子和载荷的简单相加。稳定性风险大致分为两大类：（i）物理稳定性，包括聚集、构象扰动，和（ii）化学稳定性，包括抗体、连接子或载荷的化学修饰。
ADC偶联诱导的内在稳定性
ADC需要具有高效力的载荷，因为基于抗体的药物递送系统限制了到达靶细胞的细胞毒性剂的绝对量，这就要求药物在比传统化疗小分子所用浓度低几个数量级的浓度下有效。大多数ADC中使用的小分子有效载荷，如Auristatin（MMAE）、美登素类（DM1）和喜树碱衍生物（Exatecan和Deruxtecan），都是高效力、非极性和固有疏水的。这些疏水分子的附着改变了表面电荷，增加了整体疏水性，从而降低了整体胶体和构象稳定性。差示扫描荧光技术和动态光散射实验显示，天然抗体结构的失稳与载荷疏水性的增加之间存在相关性。虽然更高的载药量可以理论上增强药物效力，但与高DAR相关的过度疏水性与聚集增加相关联。相应地，大多数商业获批ADC的DAR通常在2至4的范围内。然而，Enhertu®（DAR为8）的成功推动了一种趋势，即开发具有更高DAR的ADC，最常使用拓扑异构酶I抑制剂载荷（SN-38， Dxd）。向更高DAR的转变可能会引入额外的稳定性挑战，需要仔细选择连接子和制剂。
偶联化学和附着位点显著影响ADC的物理稳定性，影响聚集以及热稳定性。例如，常规的赖氨酸偶联方法可以通过去除正电荷赖氨酸来减少表面电荷，增加聚集风险。同样，涉及还原链间二硫键的半胱氨酸-马来酰亚胺偶联引入了疏水性连接子和载荷。研究表明，尽管保留了二级或三级结构，但此类修饰通过降低整体结构紧凑性和增加疏水性，降低了亲本抗体的稳定性。位点特异性偶联策略，如工程化半胱氨酸或酶法等，能够实现合理的位点选择以优化稳定性，这一点至关重要，因为偶联位点的位置可以调节疏水性、聚集倾向和构象稳定性。例如，在埋藏区域的偶联可以屏蔽疏水性载荷并减少聚集，而靠近溶剂暴露区域的偶联通常会增加疏水性和聚集。
连接子设计在ADC中不断发展，不仅是为了控制载荷释放，也是为了调节偶联物的疏水性和稳定性。早期连接子的设计主要基于其断裂机制和系统性稳定性。连接子类型大致可分为四类：酸可裂解、氧化还原可裂解、酶可裂解和不可裂解。除了这些裂解机制之外，最近连接子架构已被优化以纳入亲水性或带电性基团，如聚乙二醇或氨基酸残基，以增强溶解度并最大限度地减少与疏水性载荷偶联相关的ADC聚集。
外部应激引起的ADC不稳定性
在开发和产品生命周期中引入的外部应力因素，如热、pH、冻融或机械应力以及光照，可导致ADC降解。这些外部应激对亲本抗体分子的影响可导致物理化学变化，如蛋白质聚集、片段化和变性。一项研究表明，与亲本抗体相比，升高的温度会影响ADC的物理化学稳定性。ADCs通常表现出较低的热应力耐受性，这可能会使疏水区域失稳并暴露出来，从而增加聚集倾向。热敏感的程度随连接子类型和载荷疏水性而变化。一项研究评估了赖氨酸连接的ADC Trastuzumab emtansine与其亲本Trastuzumab在搅拌、冻融、pH应力以及热应力下的稳定性。总体而言，与亲本抗体相比，ADC的聚集随所施加应力的变化而增加，即使在低至25°C的温度下也是如此，而冻融应力未观察到显著变化。这种降解归因于药物-连接子的存在，导致了反相液相色谱图谱的改变以及构象稳定性的降低，影响了分子在施加的外部应力下的整体稳定性。
连接子和载荷的存在会在ADC中引入额外的pH依赖性化学不稳定性，超出了对亲本抗体充分表征的pH效应，如异构化和脱酰胺。这种敏感性可导致细胞毒性载荷的过早裂解。具体而言，含有酸可裂解连接子的腙键部分在pH 5.0下半衰期短，导致当DP制剂缓冲液的pH不适宜时发生载荷的过早释放。目前常用的酶可裂解二肽基连接子（如缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸）被设计为在制剂和储存条件下基本保持稳定，仅在细胞内化和溶酶体蛋白酶加工后才进行有效裂解。
由于其他学结构和细胞毒性活性所需的反应性官能团，ADC中使用的一些小分子载荷对光敏感。一项研究表明，ADC在相对温和的光照暴露下显示出光降解，包括氧化，而这在其对应的仅抗体部分中并未观察到。这种光敏性强烈依赖于载荷类型，对与喜树碱衍生物Exatecan偶联的ADC影响最大，因为测量到了大量活性氧（ROS）的存在。基于对其它喜树碱衍生物的研究，光降解涉及内酯环开环，表明pH可能是喜树碱衍生物ADC光敏性的重要因素之一。
此外，氧化应激也可由金属氧化剂如Cu（II）和Fe（II/III）产生的ROS以及/或在制造过程中引入，例如通过发酵培养基、缓冲液/辅料（包括表面活性剂）、隔离器灭菌、容器封闭系统所诱导。研究发现，这些金属催化反应不仅导致氧化，还会导致半胱氨酸和赖氨酸偶联的ADC的聚集和片段化变化。结果表明，偶联并未使ADC比亲本抗体更容易发生化学修饰，然而，与亲本抗体相比，在额外氧气暴露下观察到了增加的聚集。
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二、已上市ADC的制剂情况
大多数获批的ADC制剂包含一种缓冲剂和一种稳定剂，以及一种非离子表面活性剂（通常是聚山梨酯），并且其浓度配制在20 mg/mL以下，Blenrep®例外，为50 mg/mL。相对较低的DP浓度反映了这些强效药物所需的低剂量（通常远低于10 mg/kg）及其静脉给药途径，这避免了与皮下注射相关的体积限制。此外，所列的获批ADC中只有一款以液体形式上市，即Elahere®，尽管这对于已获批ADC来说不常见，但可能表明了近年来向液体ADC制剂产品发展的趋势。尽管液体剂型具有优势（无需复溶，临床给药更快），但冻干DP形式占主导地位，主要是为了增强保质期和稳定性。
所有辅料都是抗体制剂中常见的辅料。虽然组氨酸缓冲液仍然是主要选择（在公开的ADC制剂中占50%），但缓冲液类型和pH范围的整体分布比传统抗体制剂更具异质性。抗体通常配制在pH 5-7（平均约5.8），而ADC制剂涵盖了从pH 5.0至8的更宽pH范围。这种更宽的分布可能反映了除了抗体本身之外，偶联的连接子-载荷所施加的额外稳定性限制。在商业ADC中使用的两种主要偶联方法中，半胱氨酸-马来酰亚胺偶联的ADCs通常配制在微酸性条件下，介于5.3至6.6之间，推测是为了防止硫代琥珀酰亚胺环的水解并维持ADC在长期储存中的物理稳定性。相比之下，赖氨酸偶联的ADCs的制剂缓冲液pH范围涵盖了酸性（pH 5）和碱性（pH > 7.5），反映了产物对水解的敏感性降低。具体来说，赖氨酸偶联产品的微碱性制剂对应于含有酸不稳定的腙连接子的ADCs（Mylotarg®和Besponsa®），以避免载荷在制剂缓冲液中释放。
大多数获批的ADC含有一种或多种肠胃生物制品中常见的辅料。值得注意的是，所有产品都含有双糖，如蔗糖或海藻糖，其中16种中有12种含蔗糖，其余含海藻糖。甘露醇，一种糖的衍生物，也存在于Aidixi™和Tivdak®中。这些糖被报道通过优先排除机制稳定抗体的构象稳定性，有利于蛋白质的折叠状态，并在冻融和冻干过程中充当冷冻保护剂。虽然这些机制在抗体中已有充分描述，但它们在ADC稳定性中的作用仍然有限。在16种上市的ADC中，有两种出现了额外的稳定剂：Dextran 40（Mylotarg®）和NaCl（Mylotarg®中100 mM NaCl，Besponsa®中10 mM NaCl）。有趣的是，研究发现与亲本抗体相比，高离子强度（> 50 mM NaCl）的制剂通常会导致ADC的聚集和片段化增加，这归因于偶联诱导的疏水相互作用，特别是在DAR增加时。此外，辅料NaCl通常在冻干制剂中避免使用，因为它在冷冻和干燥过程中倾向于结晶，这会损害饼块完整性，因此通常在ADC产品中不太可能作为辅料包含。
虽然含有喜树碱载荷的ADC容易发生光降解，但目前上市的ADC产品中没有一个包括光敏抗体制剂中常用的抗氧化剂，如甲硫氨酸。最近的研究表明，与亲本抗体相比，优化缓冲液和辅料选择可以减轻光诱导的ADC降解。例如，组氨酸缓冲液可以充当清除剂，尽管在光应激下观察到了pH变化。通过掺入如甲硫氨酸、抗坏血酸或蔗糖等辅料可以实现额外的保护。相反，在DP层面的缓解策略主要依赖于保护性包装，如琥珀色西林瓶。关于金属催化的氧化降解，只有一款产品Blenrep®含有螯合剂（乙二胺四乙酸，EDTA），以保护其auristatin载荷。EDTA可以通过螯合催化ROS形成的金属离子来发挥保护性抗氧化作用。
非离子表面活性剂，特别是聚山梨酯20（PS20）和聚山梨酯80（PS80），在ADC制剂中无处不在，用于防止聚集，包括搅拌诱导的聚集和不希望的表面吸附，由于ADC相对于未偶联的亲本抗体具有更高的疏水性，这种吸附可能更为明显。ADC DP中50%含有PS80，而37.5%含有PS20，12.5%不含表面活性剂。ADC中的表面活性剂浓度（通常0.02-0.1% w/v）与抗体中使用的相当。
现有的信息表明ADC制剂策略在某种程度上与经典抗体制剂规范既有重叠又有不同。核心辅料如双糖和非离子表面活性剂对这两种模态仍然常见；然而，ADC引入了由连接子-载荷部分驱动的额外考量。这些限制表现为更宽的pH范围、更窄的缓冲液和辅料选择。早期认识到这些趋势对于设计稳健且适用的ADC制剂至关重要，这些制剂需平衡抗体稳定性原则与ADC连接子-载荷偶联带来的问题。
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三、ADC制剂开发策略
虽然许多原则与抗体开发一致，例如在质量源于设计（QbD）框架内进行物理化学稳定性筛选，并辅以相关的分析和统计工具，但ADC开发因连接子-载荷偶联而引入了额外的复杂性。这些独特的属性要求量身定制的方法，在不牺牲开发时间表的前提下，确保具有所需保质期的稳定DP。此外，旨在改善治疗窗口和降低毒性的下一代ADC技术的出现带来了进一步的挑战，包括多样的偶联化学和更多变的抗体支架。
早期筛选或“可开发性”评估对于抗体和ADC候选物都至关重要，可以为先导化合物选择提供信息。这些筛选利用计算机模拟和体外工具，可以识别稳定性问题并为制剂设计提供信息。抗体未偶联中间体的制剂开发应考虑预期的储存条件（即≤ −65°C），这与最终ADC DP或典型的仅抗体DP制剂（通常储存于2-8°C）形成对比。此外，应考虑辅料与偶联步骤的兼容性，以尽量减少缓冲液置换并避免干扰偶联反应的组分，例如赖氨酸偶联中的伯胺辅料（如组氨酸）。表面活性剂也应排除，因为它们难以去除并可能掩蔽反应位点，从而破坏偶联化学。
早期优化亲本抗体配方可以加速时间表并缓解供应限制，因为抗体材料通常比偶联和工艺开发更早获得。在可行时应采用高通量、基于平板的筛选方法，以节约材料并加速开发。偶联常常损害分子稳定性，因此可接受的抗体稳定性并不能确保ADC稳定性。为缓解ADC特定的问题，量身定制的制剂开发应纳入如糖、表面活性剂等辅料。系统性的策略应包括在加速和应激条件下筛选pH和缓冲系统以及辅料评估。鉴于ADC的疏水性质和通常较低的DP浓度，从而增加了表面吸附的风险，表面活性剂的选择应仔细评估。在此，聚山梨酯降解是液体剂型中已知的挑战，因为即使是来自宿主细胞的痕量脂肪酶也能驱动降解。可以使用正交分析方法以及鉴定和脂肪水解活性测定进行仔细监测。可以使用更高的聚山梨酯浓度，同时平衡聚山梨酯降解产生的过氧化物和脂肪酸的影响。鉴于早期阶段制剂和当前商业ADC产品强烈偏好冻干剂型，冻干可以防止时间依赖性聚山梨酯降解和颗粒形成。另一方面，应优化制剂参数以确保成功冻干，特别是在预期商业制剂时。这包括例如避免高盐浓度和磷酸盐缓冲液（可导致结晶和饼块结构不良的风险），或挥发性缓冲液组分如醋酸。然而，应用于其他免疫偶联物的冷冻液体DP形式，可能代表了可行的替代方案，特别是对于早期临床试验。最后，主要包装考量，通常是ADC的玻璃西林瓶，应在开发早期整合。
参考文献：
Antibody-Drug Conjugates Drug Product Formulation and Process Development, Scalability and Stability Considerations. AAPS PharmSciTech. 2026 Jun 4;27(5):224
