骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种罕见但极具侵袭性的原发性恶性骨肿瘤，多发于青少年和儿童，其特征是快速生长、早期转移以及对周围骨组织的严重破坏。尽管手术切除联合术前术后化疗是目前的主要治疗手段，但患者的五年生存率仍然有限，尤其是对于发生转移或复发的患者，生存率更是低得令人揪心。这使得寻找新的有效治疗药物成为当务之急。

近年来，一种名为铁死亡（Ferroptosis）的细胞死亡方式引起了研究者的关注。铁死亡是一种由铁催化的脂质过氧化反应引起的细胞死亡形式，与多种疾病的发生发展密切相关，包括肿瘤。研究表明，通过诱导铁死亡可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和转移，为癌症治疗提供了新的思路。而Brusatol（Bru），这种从中药鸦胆子中提取的化合物，已被证实具有抑制肿瘤转移和增殖的潜力。然而，Bru是否通过调节铁死亡来发挥其抗骨肉瘤的作用此前尚未有研究探索。

近期，一项发表于《Phytomedicine》杂志题为“Brusatol induced ferroptosis in osteosarcoma cells by modulating the Keap1/Nrf2/SLC7A11signaling pathway”的研究，探索了Bru通过诱导铁死亡发挥抗骨肉瘤作用的分子机制。图片
图1 论文首图


Brusatol在体内外均表现出对骨肉瘤的抑制作用

研究团队通过一系列实验，深入探究了Bru对骨肉瘤的影响。在体外实验中，他们使用不同浓度的Bru处理143B和MG63这两种骨肉瘤细胞系，发现Bru能够以浓度和时间依赖的方式抑制骨肉瘤细胞的生长。而在体内实验中，研究人员建立了裸鼠皮下骨肉瘤模型，以5mg/kg的多柔比星（DOX）作为阳性对照组。结果表明，Bru能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，减少肿瘤重量，且不同处理组的小鼠体重没有显著差异。此外，1mg/kg的Bru还能提高小鼠的生存率，通过活体成像技术观察到Bru处理的小鼠肿瘤体积减小。微计算机断层扫描（Micro-CT）结果显示，Bru有效缓解了骨肉瘤细胞对胫骨和腓骨的骨溶解。进一步的苏木精 - 伊红（HE）染色和器官称重实验表明，Bru处理对小鼠没有明显的毒性作用。这些发现为Bru作为潜在的骨肉瘤治疗药物提供了有力的证据。图片
图2. Brusatol在体内外均表现出对骨肉瘤的抑制作用。


Brusatol抑制143B和MG63细胞的迁移和增殖

为了探究Bru对骨肉瘤细胞迁移能力的影响，研究人员进行了24小时的划痕实验。结果显示，Bru显著抑制了骨肉瘤细胞的迁移。同时，集落形成实验表明，1μg/mL的Bru开始影响单个骨肉瘤细胞的集落形成能力。此外，通过Calcein - PI染色评估细胞存活和死亡，发现Bru处理增加了骨肉瘤细胞的死亡率。EdU增殖实验也显示，Bru抑制了骨肉瘤细胞的增殖。这些实验结果共同证实了Bru在抑制骨肉瘤细胞迁移和增殖方面的重要作用，为后续深入研究其作用机制奠定了基础。图片
图3. Brusatol抑制143B和MG63细胞的迁移和增殖  


Brusatol导致143B和MG63细胞中ROS异常积累并促进线粒体损伤

已有研究表明，许多抗癌药物通过诱导肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平升高来发挥抗肿瘤作用。研究人员利用DHE和DCFH - DA探针检测了Bru处理后骨肉瘤细胞内的ROS水平，发现Bru显著增加了细胞内ROS的积累。进一步的JC - 1流式细胞术检测表明，Bru增加了JC - 1单体的水平，同时降低了JC - 1聚集体的水平，这表明Bru改变了骨肉瘤细胞的线粒体膜电位，导致线粒体损伤。此外，流式细胞术检测还发现，Bru诱导了骨肉瘤细胞的凋亡。这些结果揭示了Bru通过诱导ROS积累和线粒体损伤来抑制骨肉瘤细胞生长的潜在机制，为后续研究其诱导铁死亡的作用机制提供了线索。图片
图4. Brusatol导致143B和MG63细胞中ROS异常积累并促进线粒体损伤  


对143B细胞进行转录组测序，处理条件为10μg/mL Brusatol处理24小时

为了深入探究Bru诱导线粒体损伤的分子机制，研究人员对经过10μg/mL Bru处理24小时的143B细胞进行了转录组测序。结果表明，Bru显著改变了143B细胞的基因表达谱，其中3289个基因表达下调，4602个基因表达上调。具体而言，Bru显著上调了SAT1、MAP1LC3B、ACSL5和ALOX15等基因的表达，而下调了FTH1和SLC7A11的表达，但对HMOX1或GPX4的表达没有显著影响。通过主成分分析（PCA），研究人员发现对照组和Bru处理组之间存在明显的分离，表明Bru处理导致了细胞全局表达谱的显著变化。基因本体（GO）富集分析显示，Bru显著调节了143B细胞的氧化应激反应、脂质代谢和铁代谢。同时，KEGG富集分析表明，Bru处理涉及调节143B细胞的铁死亡和NRF2信号通路。此外，基因集富集分析（GSEA）结果表明，与对照组相比，Bru处理与线粒体RNA过程和脂质代谢相关。这些转录组学分析结果为揭示Bru诱导铁死亡的分子机制提供了重要线索。图片
图5. 对143B细胞进行转录组测序，处理条件为10μg/mL Brusatol处理24小时  


Brusatol诱导143B和MG63细胞发生铁死亡

为了进一步探究铁死亡是否是Bru抑制骨肉瘤细胞增殖的关键机制，研究人员进行了挽救实验，使用自噬抑制剂3 - MA（5mM）、凋亡抑制剂Z - VAD - FMK（50μM）和铁死亡抑制剂Fer - 1（1μM）。CCK - 8实验结果表明，与3 - MA和Z - VAD - FMK相比，Fer - 1更有效地逆转了Bru诱导的骨肉瘤细胞活力降低，表明铁死亡可能在Bru的抗增殖作用中发挥更核心的作用。此外，通过流式细胞术检测发现，Bru显著增加了骨肉瘤细胞中亚铁离子的水平，并且使用C11 - BODIPY探针检测到Bru增加了脂质过氧化水平。同时，Western blot分析显示，Bru降低了FTH1、GPX4和SLC7A11蛋白的表达，而增加了TFRC和ALOX15蛋白的表达。细胞内谷胱甘肽（GSH）水平检测表明，Bru降低了骨肉瘤细胞中GSH的水平。这些结果进一步证实了Bru通过诱导铁死亡来抑制骨肉瘤细胞的增殖。图片
图6. Brusatol诱导143B和MG63细胞发生铁死亡  


分子对接和分子动力学分析

为了深入了解Bru如何调节铁死亡，研究人员将目光投向了Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路，这是调控铁死亡的关键通路之一。他们利用AutoDock Vina软件对Keap1和Bru的完整结构进行了分析，评估了它们之间的潜在相互作用。分子对接结果显示，Keap1和Bru之间的对接得分为 - 8.798，表明Bru与Keap1氨基酸之间存在多个氢键相互作用，且Bru能够深入结合到Keap1蛋白的口袋中。为了进一步评估系统的稳定性，研究人员进行了分子动力学模拟。均方根偏差（RMSD）分析显示，复合物在初始阶段存在一定的蛋白质结构波动，但很快稳定在0.18nm，且波动不超过0.1nm。均方根波动（RMSF）分析表明，Bru并未显著破坏Keap1的结构完整性，支持了它们之间稳定的相互作用。此外，通过分析模拟分子系统的相互作用能量，包括库仑短程（SR）和Lennard - Jones（LJ）短程相互作用能量，研究人员发现Bru与Keap1之间的相互作用能量较大且波动较小，表明Keap1 - Bru复合物之间存在强烈的相互作用力，系统已达到平衡。这些分子对接和分子动力学分析结果为Bru通过调节Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路诱导铁死亡提供了理论依据。图片
图7. 分子对接和分子动力学分析 


Brusatol通过调节Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路诱导143B和MG63细胞发生铁死亡

基于上述分子对接和动力学模拟结果，研究人员进一步通过实验验证了Bru对Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路的调节作用。Western blot分析显示，Bru增加了Keap1蛋白的表达，同时降低了Nrf2和SLC7A11蛋白的水平。此外，实时荧光定量PCR（RT - PCR）分析证实了Bru处理后Nrf2 mRNA表达的下调。流式细胞术检测也发现，Bru处理降低了骨肉瘤细胞中Nrf2的荧光强度。为了进一步验证Nrf2调节的生物学意义，研究人员进行了挽救实验，发现Nrf2激动剂artemisitene（20μM）显著减轻了Bru（10μg/mL）的细胞毒性，提高了细胞活力。此外，细胞热位移实验（CETSA）进一步证实了Bru与Keap1之间的直接相互作用，表明Bru的存在增加了Keap1在热应激下的热稳定性，为分子动力学模拟结果提供了实验支持。已知的Keap1抑制剂KI696被用于评估Keap1在Bru效应中的作用，结果表明，与Bru共处理的骨肉瘤细胞中，KI696能够逆转Bru诱导的亚铁离子水平升高、脂质过氧化增加，减轻了骨肉瘤细胞活力的降低和GSH水平的下降。这些实验结果共同证实了Bru通过调节Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路诱导骨肉瘤细胞发生铁死亡，为Bru作为潜在的骨肉瘤治疗药物提供了明确的作用机制。图片
 
图8. Brusatol通过调节Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路诱导143B和MG63细胞发生铁死亡  


Brusatol与化疗药物DOX的联合使用增强了DOX对143B和MG63细胞的抑制效果

联合化疗是当前肿瘤治疗的重要趋势之一，尤其是与已有的化疗药物联合使用。研究人员利用Compusyn软件量化了Bru与DOX之间的协同效应，结果表明，当DOX浓度大于或等于1μM时，Bru（5μg/mL）与DOX的联合指数（CI）小于1，表明Bru与DOX之间存在协同作用。此外，研究人员还评估了不同浓度DOX对MC3T3、BMSCs和HUVEC细胞活力的影响，发现即使在10μM的浓度下，DOX对这些细胞的活力也没有显著影响。为了评估Bru与DOX联合用于骨肉瘤的疗效，研究人员进行了划痕实验、集落形成实验和EdU实验。结果表明，与单独使用DOX的组相比，Bru + DOX组的骨肉瘤细胞活力进一步降低，肿瘤细胞迁移抑制更为显著。此外，集落形成实验表明，Bru + DOX组对单个骨肉瘤细胞集落形成能力的抑制最为显著，EdU实验也证实了Bru + DOX组中增殖的骨肉瘤细胞最少。为了探究其协同作用的机制，研究人员进行了挽救实验，使用铁死亡抑制剂Fer - 1、自噬抑制剂3 - MA和凋亡抑制剂Z - VAD - FMK。CCK - 8实验结果表明，Z - VAD - FMK最显著地恢复了骨肉瘤细胞的活力，表明激活凋亡途径可能是Bru - DOX协同作用的关键机制。流式细胞术分析也证实，Z - VAD - FMK显著减轻了Bru和DOX诱导的凋亡，进一步证实了凋亡信号在它们联合治疗效果中的核心作用。这些结果表明，Bru与DOX的联合使用通过激活凋亡信号通路增强了DOX对骨肉瘤的抑制效果，为克服骨肉瘤化疗耐药性提供了新的策略。
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图9. Brusatol与化疗药物DOX的联合使用增强了DOX对143B和MG63细胞的抑制效果 



小结

本研究深入探讨了Bru在骨肉瘤治疗中的潜力，揭示了其通过诱导铁死亡发挥抗骨肉瘤作用的分子机制。研究结果表明，Bru不仅在体内外均能显著抑制骨肉瘤细胞的生长，还能通过调节Keap1/Nrf2/SLC7A11信号通路诱导铁死亡，且与化疗药物DOX联合使用时能够增强DOX的抗骨肉瘤效果。这些发现为开发新的骨肉瘤治疗策略提供了重要的理论依据和实验支持，也为中医药在现代医学中的应用开辟了新的道路。

参考文献：
Zhang L, Luo D, Ren H, Fan W, Yu Z, Wang S, Wu X, Xu Y, Li S. Brusatol induced ferroptosis in osteosarcoma cells by modulating the Keap1/Nrf2/SLC7A11 signaling pathway. Phytomedicine. 2025 Aug;144:156912. doi: 10.1016/j.phymed.2025.156912. Epub 2025 May 30. PMID: 40494017.


作者｜梅斯医学
编辑 | 逅思
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