引言
嵌合抗原受体（CAR）工程化免疫细胞疗法是癌症治疗领域的一项重要突破。目前已有七款FDA批准的CAR-T细胞产品在治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤方面取得了临床成功。然而，目前所有FDA批准的CAR-T细胞产品均基于体外工程化的自体T细胞。
然而，复杂性和高昂成本是与自体CAR-T细胞疗法相关的主要挑战。为每位患者定制T细胞产品而非制备标准化批量药物，带来了巨大的生产和物流难题。为解决自体CAR-T细胞疗法的生产问题，研究人员开发了几种策略。其中一种有前景的方法是使用来自健康供体的“现成”异体CAR工程化细胞产品。这种方法具有若干优势，包括冷冻保存产品的即时可用性、生产的标准化、充足的细胞改造时间以及通过工业流程降低成本。但是，异体CAR-T细胞存在危及生命的移植物抗宿主病（GvHD）风险。尽管正在开发减轻这些风险的策略，但异体CAR-T细胞的给药仍需要淋巴细胞清除以防止宿主免疫排斥，这一过程通常伴随长期血细胞减少、中性粒细胞减少和频繁的感染并发症。
直接体内生成CAR-T细胞代表了一种有前景的替代方案，以应对当前体外生成的自体和异体CAR-T细胞疗法面临的挑战。一种促进CAR工程化免疫细胞体内生成的“现成”产品将能够简化治疗药物生产、消除患者特异性制造需求并简化制造物流，从而节省成本并缩短治疗时间。此外，使用非整合型载体的体内方法在避免T细胞耗竭和安全性问题方面可能优于体外永久基因修饰的CAR-T细胞。
目前，多种策略正在临床前阶段被探索用于体内生成CAR-T细胞。这些方法包括使用脂质纳米颗粒（LNP）包装的核酸（mRNA或质粒DNA）、包裹核酸的聚合物纳米颗粒、慢病毒或腺相关病毒（AAV）递送系统、生物指导性可植入支架的混合方法，以及Cas9包装包膜递送载体和病毒模拟融合纳米囊泡。每种递送平台在细胞特异性靶向、潜在系统效应以及插入突变风险方面都有独特的优势和劣势。
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一、体内CAR-T细胞工程的具体策略
LNP包装的核酸递送系统
mRNA负载的LNP技术利用了完善的临床制造基础设施，这一点在COVID-19疫苗的大规模生产中得到验证。此外，FDA的批准确认了其安全性，并突显了其在更广泛治疗应用中的潜力，包括体内CAR工程。一旦给药，LNP-mRNA被各种类型细胞摄取，特别是静脉注射时被肝细胞摄取。细胞摄取后，mRNA从内体逃逸进入细胞质，在那里被短暂翻译后降解。抗体偶联在LNP表面可以促进特定细胞类型的摄取。由于mRNA局限于细胞质、固有地不稳定、不能整合到基因组中并在细胞分裂过程中被稀释，因此使用LNP-mRNA的工程方法本质上是短暂的。因此，使用LNP-mRNA的体内CAR工程治疗方法可能需要频繁的连续给药以维持治疗效果。
临床前研究表明，使用LNP-mRNA技术体内工程化CAR-T细胞在癌症免疫治疗方面具有巨大前景。这种方式产生的CAR-T细胞的瞬时性质可能限制潜在毒性并允许精确剂量给药，且该方法在注射前不需要淋巴细胞清除。目前大多数使用LNP体内生成CAR-T细胞的努力都涉及将靶向CD3、CD4、CD5、CD7和CD8的抗体或单链可变片段整合到LNP中。
一项在Burkitt淋巴瘤人源化NSG小鼠模型中的研究显示，使用CD3靶向抗体表面偶联的LNP系统包裹编码人CD19 CAR和IL-6靶向短发夹RNA的DNA质粒，在注射后21天实现了80%的人T细胞CAR转染率，CAR-T细胞持续存在超过90天并介导了显著的肿瘤抑制。IL-6靶向短发夹RNA的整合减轻了细胞因子释放综合征（CRS）的风险。然而，观察到脱靶CAR表达，因为一些LNP也转染了体内的巨噬细胞。
聚合物纳米颗粒递送系统
阳离子可生物降解的聚合物制剂通过静电相互作用与阴离子核酸自组装，并在内吞后经历pH依赖性内体逃逸。这些聚合物已被功能化，通过偶联含有微管相关序列和核定位信号的肽，利用微管运输机制促进其遗传货物的快速核输入。PBAE聚合物纳米颗粒是可生物降解的，半衰期短，并且在动物模型中表现出良好的耐受性。这些纳米颗粒可以使用纳米沉淀、乳液聚合或溶剂蒸发等技术高效稳定地生产。此外，冻干使聚合物纳米颗粒能够以干燥粉末形式储存，便于储存，增强稳定性并降低成本。
为了将PBAE聚合物纳米颗粒特异性靶向T细胞，聚谷氨酸被偶联到靶向CD8或CD3的抗体上，所得复合物静电吸附到PBAE颗粒上。这些靶向纳米颗粒随后可装载编码CAR构建体的质粒DNA（可设计为整合或不整合到基因组中）、转座子DNA（可促进构建体整合到安全港位点）或mRNA。
PBAE聚合物纳米颗粒已成功用于在白血病、前列腺癌和乙型肝炎诱导的肝细胞癌的临床前模型中体内转导T细胞，实现了与传统过继性CAR-T细胞疗法相当的肿瘤消退效果。然而，使用包裹mRNA的纳米颗粒实现高效的CAR工程和抗肿瘤功效需要多次给药纳米载体，因为CAR表达是瞬时的。重要的是，这些纳米载体的现成可用性允许根据需要进行方便的重复给药。相比之下，PBAE聚合物纳米颗粒DNA递送方法存在与转座子基因整合相关的潜在插入突变风险，其临床可行性仍有待充分确定。
总的来说，PBAE聚合物纳米颗粒的简单稳定的制造过程简化了储存和成本考虑。这种方法可能代表一种可行、灵活且广泛适用的解决方案，用于在体内诱导CAR-T细胞介导的免疫。然而，与LNP相比——后者具有更高的包封效率、更强的降解保护能力和已确立的安全性特征，特别是在临床mRNA疫苗应用方面——PBAE纳米颗粒需要进一步研究其可扩展性、长期生物相容性和潜在毒性。
慢病毒递送系统
慢病毒是逆转录病毒的一个亚类，具有球形、包膜结构和一个单链RNA基因组，以其整合到宿主基因组并从而实现转基因长期表达的能力而闻名。慢病毒载体已被广泛用于将外源基因递送到T细胞。然而，它们在体内的感染效率通常受到慢病毒对靶细胞低亲和力以及T细胞通常处于静止状态的限制。为优化这些载体的体内T细胞转导，它们被用各种病毒包膜进行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒和Cocal融合糖蛋白的包膜。此外，慢病毒可以经过工程改造，在包膜蛋白和其他病毒表面蛋白上表达靶向配体，以进一步增强T细胞趋向性。
例如，使用靶向CD8的scFv慢病毒载体在人源化NSG小鼠中体内生成了CD19靶向的CD8+ CAR-T细胞。注射该载体7天后，30-50%的CD8+ T细胞表达了CAR，并有效消除了淋巴瘤细胞。另一项研究在NSG小鼠中使用具有CD4特异性DARPin的慢病毒载体，在腹腔注射人PBMCs后7天，通过腹腔给药实现了约40-60%的CD4+ T细胞的CAR转导率。
最近，一种改良的慢病毒递送平台在非人灵长类动物模型中进行了测试。该载体除了抗CD3 scFv外，还整合了共刺激配体CD80和CD58，从而显著增强了体内CAR-T细胞的活化和抗肿瘤功能。这些载体体内生成的CD20靶向CAR-T细胞占循环T细胞的65%，并导致B细胞完全清除长达76天，表明其在治疗B细胞恶性肿瘤和B细胞介导的自身免疫性疾病方面的强大功效。
慢病毒已被广泛采用于体外治疗应用，临床级生产方案和试剂现已完善，它们能够实现CAR转基因的稳定整合和表达。然而，在体内使用这些载体时，由于永久的病毒整合，安全性问题更加突出，引发了关于受控整合、潜在无意突变和长期后果的问题。因此，慢病毒载体的体内应用需要对靶细胞类型进行严格控制，并可能在获得批准广泛应用之前，在严格的安全性评估后才可以考虑进行临床试验。
AAV递送系统
AAV是一种小型、无包膜病毒，具有二十面体衣壳结构和单链DNA基因组，不整合到宿主基因组中。AAV衣壳可以经过工程改造以呈现各种蛋白质，包括scFv和DARPin。衣壳的修饰对于实现特异性细胞靶向和减少其他细胞的非特异性摄取至关重要。
AAV已成为治疗性基因递送的关键载体，这归功于其实现长期转基因表达和有效疾病表型校正且毒性最小的能力。与慢病毒载体相比，AAV DNA以稳定的游离体形式存在，抵抗外切核酸酶的降解，并利用宿主内质网进行脱壳。这种稳定性和以游离体形式持续存在的能力使AAV成为非常适用于体内基因操作的载体，因为它不构成插入突变的风险。
一项AAV介导的体内CAR基因治疗策略已用于在人源化小鼠模型中靶向人CD4+ T细胞白血病。在这项研究中，AAV载体经过工程改造以递送一个线性单链DNA质粒，该质粒编码靶向人CD4的scFv，以及共刺激受体CD28和4-1BB以及CD3ζ TCR亚基的信号传导结构域。单次给药该载体成功产生了能够诱导肿瘤消退的CAR-T细胞。
AAV编码的CD4靶向CAR构建体的持续存在和记忆T细胞的生成可能在临床环境中加剧CD4+ T细胞再生障碍，强调了为该治疗策略开发有效安全开关的必要性。尽管如此，基于AAV的方法代表了推进体内T细胞工程技术的坚实基础，其潜在应用扩展到癌症和传染病以外的领域，如自身免疫性疾病和器官移植。
生物指导性可植入支架
可植入的多功能海藻酸盐支架，搭载病毒载体以介导体内CAR-T细胞工程和释放，代表了体内和体外策略之间的混合方法。它们仍然需要初始从患者体内分离T细胞，但处理时间减少到一天。与其他体内工程方法不同，海藻酸盐支架提供了一个局部和受控的微环境，增强了T细胞、病毒载体、细胞因子和趋化因子之间的相互作用。这种空间限制提高了CAR转导效率，同时最小化了与全身T细胞工程相关的潜在系统性副作用。
一个例子是基于海藻酸盐的支架，包含靶向人CD3和CD28的抗体，以及人IL-2以促进T细胞增殖。该支架在植入前装有自体PBMC和逆转录病毒。这种设置促进了病毒载体介导的基因转移，并支持功能性CAR-T细胞的体内生成和释放。在CD19+淋巴瘤的人源化小鼠模型中，这种方法释放了大量的CD19 CAR-T细胞，在控制肿瘤生长方面与传统的体外生成的CAR-T细胞同样有效，但表现出更优的扩增和持久性。
另一种生物指导性可植入支架设计基于胶原蛋白，上面偶联了抗人CD3/CD28抗体、慢病毒和选定的趋化因子。该支架不是搭载T细胞，而是设计用于招募、工程化、扩增和释放肿瘤浸润淋巴细胞以治疗实体瘤。
总体而言，生物指导性可植入支架技术为体内CAR工程提供了一种新颖方法，将CAR-T细胞制造和递送整合到一个单一平台中。它创建了一个局部、支持性的微环境，用于CAR-T细胞的激活、增殖和释放。尽管生物指导性可植入支架可能非常适合治疗血液系统恶性肿瘤和可触及的实体瘤，如黑色素瘤和乳腺癌，但它们在靶向内部或具有挑战性解剖部位（如肝脏、肺和脑）的实体瘤方面的适用性可能更复杂。
Cas9包装包膜递送载体
脱靶效应可能源于病毒和病毒衍生颗粒对非靶细胞的非预期转导，这对体内基因工程构成了重大限制。为解决此问题，已开发出一种技术，使用可预测的抗体-抗原相互作用，将基因组编辑机制瞬时递送至特定靶细胞，从而实现精确和永久的基因组位置编辑，同时最小化对旁观细胞的脱靶效应。该方法使用基于逆转录病毒样颗粒的Cas9-EDV，可通过偶联特异性针对CD3、CD4或CD28的scFv来靶向T细胞。该方法被用于同时体内工程化CD19 CAR表达并敲除TCRα恒定区基因座，从而创建异体工程化T细胞并降低GvHD风险。
与使用偶联scFv或DARPin的递送载体的其他体内工程策略类似，scFv-抗原相互作用的特异性确保Cas9-EDV将其有效载荷递送至特定细胞类型，而不会递送至非特异性摄取颗粒的其他细胞，如肝细胞。总体而言，与使用病毒载体的体内工程方法相比，该平台能够将分子货物精确递送至特定细胞类型，促进复杂的基因组修饰，如CAR工程和靶向基因敲除。
病毒模拟融合纳米囊泡
预制的CAR蛋白也可以直接插入到体内T细胞膜中。这种方法确保CAR蛋白的存在时间有限，降低了持续性CAR介导的T细胞激活引起的CRS风险，并且没有插入突变的风险。
通过病毒模拟融合纳米囊泡实现了工程化蛋白的直接插入，这些囊泡含有T细胞融合原——特别是抗人CD3 scFv——以及CAR，如CD19 CAR。静脉注射后，FuNVs与T细胞膜融合，并促进CAR整合到T细胞膜中，从而在体内产生CAR-T细胞。在人源化小鼠模型中，通过这种方法产生的CD19 CAR-T细胞有效消除了CD19+ B淋巴瘤细胞，而不诱导CRS。
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二、其他免疫细胞的体内CAR工程
鉴于体内CAR-T细胞工程方法的令人鼓舞的临床前结果，其他免疫细胞——特别是NK细胞、单核细胞和巨噬细胞——的体内工程也已被探索。其中，CAR-巨噬细胞受到特别关注，主要有两个原因。首先，巨噬细胞的先天吞噬特性使其非常有效地内化纳米颗粒，这增强了它们对体内转导的适用性。其次，巨噬细胞具有自然浸润肿瘤的能力，肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的主要细胞类型。
CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞已通过使用一种腔内可注射的纳米-水凝胶超结构生成，该结构设计用于将胶质瘤干细胞特异性CAR基因递送到巨噬细胞和小胶质细胞中。在胶质瘤模型中，这些CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞在肿瘤微环境内刺激适应性抗肿瘤免疫反应，并通过诱导长期抗肿瘤免疫来防止术后胶质瘤复发。
对于脑干胶质瘤，开发了一种合成通用DNA纳米载体，用于实现瘤内递送并用特异性靶向ERBB2的CAR重编程巨噬细胞。这种方法利用可生物降解的PBAE聚合物纳米颗粒，功能化RP-182肽，该肽结合并激活M2样巨噬细胞上的甘露糖受体CD206。通过靶向巨噬细胞，该策略促进其从M2极化表型重编程为M1极化表型。
尽管瘤内基因递送方法对某些局限性实体瘤有效，但静脉基因递送对于全身性治疗细胞分布和治疗转移性癌症仍然至关重要。一种含有带正电荷的甘露糖化壳聚糖寡糖-精氨酸的脂质体纳米转运器被证明在静脉注射后靶向瘤内巨噬细胞，该纳米转运器可装载编码CAR构建体的DNA。
其他免疫细胞类型，包括NK细胞、NKT细胞和中性粒细胞，也已被用CAR工程化用于癌症免疫治疗。尽管尚未实现CAR-NK细胞、CAR-NKT细胞或CAR-中性粒细胞的靶向体内工程化，但由于它们表达CD8α链——工程慢病毒颗粒中单链抗体的靶抗原——CD19特异性CAR-NK和CAR-NKT细胞已被无意中在体内生成。
总体而言，T细胞以外免疫细胞的体内工程为CAR-T细胞提供了一种有前景的替代方案，利用了这些细胞类型固有的特性。
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三、超越癌症的体内CAR工程
近年来，CAR技术已扩展到癌症之外的领域，包括感染性疾病、自身免疫性疾病和纤维化。CAR技术应用于非癌症适应症的例子包括CD19、BCMA、DSG3和CD20靶向的CAR-T细胞现在用于靶向自身免疫性疾病中的自身反应性B细胞，如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力和寻常型天疱疮。此外，靶向HIV gp120糖蛋白的CAR-T细胞疗法目前正在对两名患者进行I/II期剂量递增研究。CAR治疗的其他潜在适应症包括哮喘、乙型和丙型肝炎病毒感染、心脏纤维化、SARS-CoV-2感染和阿尔茨海默病。
在非癌症适应症的体内CAR工程临床前结果已在心脏纤维化小鼠模型中获得。在这里，T细胞被工程化表达成纤维细胞激活蛋白靶向的CAR，该蛋白结合使心肌僵硬并阻碍心脏功能的活化成纤维细胞。这是通过使用CD5靶向的LNP包裹FAP-CAR mRNA实现的，导致T细胞中瞬时FAP-CAR表达。心脏切片显示心脏中超过一半的CD3+ T细胞表达了FAP-CAR并定位于FAP+成纤维细胞区域，治疗小鼠表现出纤维化减轻和心脏功能恢复。
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四、体内与体外CAR工程的比较
物流比较
体外工程化自体CAR-T细胞在商业市场和临床试验中的需求不断增长，揭示了自体工程化T细胞制造能力的重大局限性。在美国，所有体外生成的自体CAR-T细胞产品目前都在中心设施生产，周转时间从16到33天不等，可能导致患者治疗的危险延迟。通过扩大规模来缩短生产时间是不可行的，因为活细胞产品的集中制造涉及复杂的物流。相反，需要通过建立更多分散的和本地的制造设施来"横向扩展"，以提高自体细胞疗法的生产能力。然而，本地细胞制造设施与集中设施相比面临更高的成本，因为需要专门的设备和昂贵的试剂，因此限制了其物流可行性。体外工程自体CAR-T细胞疗法的制造和管理成本也很高，这是由于涉及白细胞分离、基因工程和细胞扩增的多步骤过程。相比之下，异体CAR-T细胞方法提供了一种更具成本效益的替代方案，具有更大的可扩展性和现成可用的优势。
体内CAR工程策略由于其"现成"特性——简化了放行测试和供应链，从而降低了成本和缩短了时间——以及其自体性质，为自体和异体体外生成的CAR-T细胞提供了一种有前景的替代方案。使用LNP-mRNA平台的体内CAR工程方法的临床转化可能受益于COVID-19疫情期间为疫苗生产开发的商业化制造基础设施。
疗效比较
尽管在血液肿瘤中取得了成功，但体外生成的自体CAR-T细胞疗法治疗实体瘤的疗效仍然有限。新兴的体内CAR工程方法提供了一种有前景的替代方案，因为这种方法在肿瘤微环境内持续修饰和扩增治疗性免疫细胞。这一动态过程通过克服与体外生成的CAR-T细胞相关的持久性和次优归巢限制，增强了它们的有效性。
此外，所有体外生成的CAR-T疗法通常涉及淋巴细胞清除步骤以为输注的CAR-T细胞"创造空间"，这可能导致免疫抑制和相关风险。相比之下，体内CAR工程消除了对淋巴细胞清除的需求，保留了患者的免疫系统。这种方法可能增强表位扩散，并维持免疫系统识别和靶向肿瘤的能力。如果肿瘤细胞通过下调CAR配体逃避检测，内源性免疫反应仍然可以识别它并发动抗肿瘤防御。
使用体内CAR工程的非整合型载体的一个潜在好处是允许CAR构建体的暂时表达和中间有休息期的连续给药，这可以避免由慢性刺激引起的CAR-T细胞耗竭。相比之下，在体外生成的自体CAR-T细胞中，由于体外长时间激活和扩增，在输注前已观察到耗竭，从而降低了它们输注后的有效性。
体内CAR工程还使得共递送小干扰RNA以暂时沉默特定基因，或递送编码细胞因子的mRNA以暂时增强T细胞活性和持久性成为可能，而没有"过度工程化"的风险——正如在体外方法中所观察到的，引入多个永久基因修饰可能损害T细胞适应性。这种灵活性允许更动态的治疗策略，同时减轻TME的免疫抑制效应。
尽管有这些优势，体内CAR工程在疗效和特异性方面仍面临挑战。与自体CAR-T细胞相比——后者通过受控的体外操作在给药时立即提供大规模的治疗性细胞——体内CAR工程最初生成的CAR-T细胞数量要少得多。这些细胞必须在患者体内随时间逐渐扩增，可能延迟治疗效果。然而，与体外生成自体CAR-T细胞所需的7-22天延迟相比，一旦初始扩增阶段完成，体内方法可能提供更快的治疗反应。
体内CAR-T疗法的另一个重要限制，特别是在肿瘤学中，是患者免疫系统的受损状态。体外制造允许选择和扩增最优的T细胞，但这些补偿过程在体内CAR-T工程中不可用。对于接受淋巴细胞清除的癌症患者，适合体内工程的功能性T细胞稀缺可能限制治疗疗效，可能导致次优的临床结果。
药代动力学参数为体内CAR工程引入了进一步的复杂性，因为活细胞、纳米颗粒和载体在体内的分布和迁移变化很大。此外，尽管瞬时CAR表达在避免T细胞耗竭方面有优势，但对于非整合型载体，CAR表达的短持续时间可能影响疗效。允许稳定整合的平台，如使用慢病毒载体的平台，可以规避这个问题，但构成插入突变的风险。
安全性和毒性比较
体内CAR工程可以提供若干显著的安全性和毒性优势，优于自体CAR-T细胞疗法。所有体内CAR工程策略的一个实质性优势是它们不需要治疗前的淋巴细胞清除化疗，从而避免了相关风险。此外，非整合型载体允许实时剂量调整，这可以显著降低毒性和长期副作用，包括CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征。mRNA和AAV载体已证明的安全性特征，在COVID-19疫苗和几种FDA批准的疗法的开发和部署中确立，突出了体内CAR工程快速商业化的潜力。此外，纳米颗粒和mRNA可以以无细胞方式生产，从而产生明确的理化性质，最小化产品变异性。这种受控的生产过程确保了稳定的质量控制，这是临床应用的关键因素。此外，mRNA和AAV疗法的给药没有插入突变的风险，因为遗传物质被递送至细胞质并在其中翻译，从而避免整合到宿主基因组中。
尽管有这些优势，体内CAR工程面临几个重要挑战。由于成功到达靶器官或细胞的颗粒比例有限，通常需要高剂量载体。载体的全身给药可能导致剂量限制性毒性，包括肝损伤。对载体的炎症反应，如补体系统介导的超敏反应，也构成了实质性障碍。然而，这些免疫反应也可能通过激活抗原呈递细胞、增强细胞因子产生和促进T细胞启动，从而增强抗肿瘤免疫，因此可能增强CAR-T细胞的扩增和功能。
脱靶递送仍然是一个关键问题，因为它可能导致非靶细胞中非预期的CAR表达，可能破坏正常细胞功能并引起不可预见的并发症。尽管慢病毒载体与非整合型载体的瞬时性质相比提供了更稳定和持久的CAR表达，但它们永久整合到宿主基因组中构成了长期脱靶效应的风险（除了插入突变的风险）。因此，它们需要被仔细靶向以防止脱靶转导，特别是生殖细胞，在这些细胞中基因转移可能导致种系转化和可遗传的遗传修饰。考虑到这些担忧，非整合型载体或位点特异性整合载体目前比慢病毒载体更受青睐，用于体内CAR工程，以增强安全性并最小化基因组破坏。
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结语
1.In vivo CAR engineering for immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2025 Oct;25(10):725-744
