今天分享一篇题为“Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors”的文章，它的核心是一种叫作“synNotch受体”的技术，synNotch受体是人工构建的膜蛋白（合成受体），具有抗原结合特异性和转录调控活性。

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关于CAR(chimeric antigen receptor, 肿瘤嵌合抗原受体)-T细胞疗法：“过继性T细胞转移(adoptive T-cell transfer，ACT)的一种”Gross 等人在1989年首次引入，已经发展到第四代，并且直到最近还处于迅速发展的过程中。CAR分子位于T细胞的细胞膜上，可特异性识别抗原，然后引发一系列胞内事件，包括T细胞激活和杀伤反应等。CAR-T被称为“抗肿瘤明星”。不过这种疗法亦有副作用，比如神经毒性（脑水肿、头晕、癫痫发作、听力受损）、细胞因子释放综合征(CRS)甚至细胞因子风暴和过敏反应等，有时非常严重，甚至可能会引起死亡。
“脱靶”是副作用的一个重要原因：有时癌细胞表面存在的蛋白（抗原）也会存在于正常细胞上，于是这可能会导致正常细胞被CAR-T细胞“误杀”，“很可能并不存在一种那样的蛋白质，能将肿瘤与正常细胞截然地区分开来”。于是，synNotch-CAR-T细胞技术的重要性就在于，一般细胞与细胞之间的精准识别都是靠多个受体（多个分子之间）的相互识别而实现的，而不只是单一的受体。
无论如何，这些实验想要做的是实现更加精确的肿瘤细胞识别，避免T细胞“误杀”正常的细胞。这就使得这项技术的前景确实显得十分诱人。
Notch受体——如果你听说过Notch信号通路，那么应该会有所知悉。Notch基因的历史渊源非常久远，可以追溯到1917年果蝇集中营营长摩尔根先生对果蝇的研究，Notch是“缺刻”（翅）的意思。Notch受体（信号通路）对生长发育非常关键。这个信号通路的组成：
  • Notch受体——哺乳动物有Notch 1~4，分子量~300kDa，单次跨膜（于是被分为胞外区、胞内区、跨膜区）。胞外区：与配体结合的部分是富含半胱氨酸的EGF样重复序列。重复序列可重复多达三四十次，每段重复约40个氨基酸，另外还含有LNR和HD结构域；胞内区：有核定位信号和转录调控（激活）结构域，还有一些其他的东西，诸如重复序列和RAM结构域（与CSL结合）等。
  • Notch配体——五种，Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4、Jagged 1、Jagged 2。
  • CSL DNA结合蛋白——转录因子。

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Notch受体结合配体之后，经「肿瘤坏死因子-α转化酶(tumor necrosis factor alpha converting enzyme, TACE)/解整合素与金属蛋白酶结构域蛋白(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein, ADAM)（这一串长名字是怎么缩写成ADAM就不要问我了）金属蛋白酶」与γ-分泌酶作用，胞外段和胞内段分别被酶切。胞内段是转录调控因子，因此随后进入细胞核调控基因表达。

在这之前，TACE/ADAM酶切位点被Notch受体三个Lin-12 Notch重复序列(Lin-12 Notch Repeats， 即之前提到的LNR结构域)遮住。与配体结合使得Notch受到机械力牵引导致被拉长，TACE/ADAM酶切位点被暴露出来，从而被TACE/ADAM酶切。这一步之后，γ-分泌酶进而切割Notch受体的胞内段。严格来讲，Notch受体如要发挥作用，必须结合膜蛋白（膜配体）。

Notch拥有这样的特性，于是，就产生了改造Notch受体的想法。——将「EGF样重复序列」（Notch受体特异性识别配体的部分）和胞内的转录调控区替换一下，换成别的：

比如，对于前者——换成scFv（单链抗体）、LaG16/17、纳米抗体(nanobody)等；对于后者——换成Gal4-VP64、LexA-VP64、Gal4-KRAB（Gal4/LexA是DNA结合结构域，VP64、KRAB有转录调控（激活/抑制）的作用）、tTa、ZFHD1等，这样就可以当做接口，参与线路搭建了。CAR-T细胞可以看做是这种思路的一个具体实践，正如作者所说，“细胞之间通常是通过整合来自多重受体的信息来识别它们的‘同伴’的，这种水平的识别，单独的受体互作一般难以实现”。人为构建的Notch受体，即“合成(synthetic)的Notch受体”，简称synNotch(-)R。

这篇文章尝试了所有三种逻辑线路，也就是与门，或门和非门，不过具体情况要复杂些：

比如与门(AND gate)的构建，是这样一个思路：

配体A被(anti-)A synNotchR结合（加不加anti-没有什么意义上的区别，或者为了既凸显anti-又图方便，可直接标记为αA synNotch-R），结合后A synNotchR激活(anti-)B CAR/TCR的表达，B CAR识别B激活T细胞，介导对靶细胞的杀伤。于是就是这样一个逻辑：若（因为）【靶细胞表面存在A】且【靶细胞表面存在B】，则（所以）【杀死靶细胞】。写成线路的形式就是：

anti-A synNotch-R → anti-B CAR/TCR

实验：T细胞黑素瘤抗原1(melanoma antigen recognized by T cells 1, MART1)是存在于黑素瘤细胞表面的一种抗原，表达MART1-TCR的T细胞能杀死这样的黑素瘤细胞。但表达靶向MART1的T细胞受体(TCR)的T细胞会误杀一些正常细胞，导致诸如葡萄膜炎、白癜风、听力丧失等副作用。研究发现多数黑素瘤细胞还表达另一种抗原——肝细胞生长因子受体MET（与此同时在黑素细胞表面只有很微弱的表达）。于是，构建如下线路：

anti-MET synNotch-R → anti-MART1(HLA-A2) TCR

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结果：遭遇M202(MET+/MART1+)系黑素瘤细胞时，表达该线路的CD8+ T细胞显示强烈的增殖和细胞毒性效应。M262(MET-/MART1+)系黑素瘤细胞遭遇未显著激活这些细胞。

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其实关于双抗原和多抗原CAR-T的构建以前也有过尝试，如构建针对ErbB2的CAR-CD3-ζ和MUC1的CAR-CD28，通过这样的共刺激信号引发IL-2的表达，确实可以有效降低对正常细胞的“误杀”。（第二代和第三代CAR-T技术曾通过叠加共刺激信号来增强CAR-T细胞的杀伤能力，尽管仍是单抗原靶向。于此可看出也许这种策略对曾经的技术不无借鉴。其实多重信号逻辑门编程也是CAR-T细胞疗法技术更新换代之必然要求，否则副作用会随着CAR-T细胞疗法效果的增强而增强。）
另外，研究者还构建了inNotch受体——靶向pMHC的Notch受体，分别做了αAFP/pMHC inNotch-R → BFP、αAFP/pMHC inNotch-R → αHer2 CAR（Her2：human epidermal growth factor receptor-2(人表皮生长因子受体)）、αWT1/pMHC inNotch-R → αHer2 CAR（WT1：Wilms tumor(威尔姆氏瘤) 1）的实验（证明效果良好），这样还可以将诸多胞内抗原纳入synNotch系统：

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“非门”(OFF gate)的构建——被称为OFF-Notch。毫无疑问，这是用来针对在正常细胞上表达而在癌细胞上不表达的那些抗原（蛋白）的。
思路：在这之前也有过经典的“非门”研究，这就是抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，简而言之就是激活胞内的抑制信号，但关于这些受体的探索结果似乎并不那么理想。OFF-Notch受体则直接引发凋亡——研究者构建了一个能激活凋亡蛋白的转录激活结构域作为synNotch-R的胞内部分，并且尝试了多几种凋亡蛋白，发现tBID是效果最好的：

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关于(t)BID：Wang et al., 1996（补链15）首先分离；BID(22kDa)是Bcl-2家族BH3-only亚家族的成员。肿瘤坏死因子R1/Fas受体的激活导致Caspase-8切割BID，形成截短(truncated)的BID蛋白即tBID(15kDa)，tBID引发Bak或者Bax在线粒体膜上寡聚化，引发细胞色素C释放，细胞色素C结合（激活）凋亡蛋白酶激活因子1(Apoptotic protease-activating factor 1, Apaf1)，后者（需要Cyt-c和dATP）继而结合（激活）Caspase-9（参与到凋亡蛋白体(apoptosome)的形成中并二聚体化，然后发生自切割，从而从前体的Procaspase-9成为成熟的Caspase-9），Caspase-3和-7也随之被激活，继而引发各种下游事件，从而导致引发细胞凋亡。（一个概述而已（况且也不是本文主题），供大家了解，这个过程迄今为止还有很多模糊之处，其中的理论论述一再受到新近研究的挑战。）
实验与结果：
构建如下线路：
αGFP synNotch-R-LexA-VP64 → αCD19 CAR + αHer2 OFF-Notch-R-Gal4-VP64
因为涉及到两个不同的synNotch受体，所以使用了不同（且正交）的转录激活结构域——LexA-VP64和Gal4-VP64。这个线路的结果是：若（因为）【靶细胞表面有GFP】且【靶细胞表面有CD19】且【靶细胞表面没有Her2】，则（所以）【杀死靶细胞】。实验的效果是良好的。

 

不过作者发现，非门在跟与门结合构成三靶向的线路时，比直接与单个CAR构成二靶向线路效果要更好，后者中凋亡线路不能有效遏制“误杀”。这被归结为时间问题，与直接表达CAR引发的免疫反应相比，synNotch-R刺激下表达的CAR所介导的免疫反应在实际上有所推迟，给了凋亡蛋白足够的时间来关闭这个线路。

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在下面我们会说到串联线路和并联线路构建三靶向与门，研究显示并联线路会导致“误杀”（但原因不明），而串联线路没有误杀且构建起来更加简单。串联在同一条线路上synNotch受体越多，CAR引发的下游免疫反应的时间就会越往后推，那么非门的效果按说就越好。不过，虽然文章里没有说，但时间可能是个更为严重的问题。如果是这样一个逻辑——若（因为）【靶细胞表面有A】且【【靶细胞表面没有B】或【靶细胞表面没有C】或【靶细胞表面没有D】……】，则（所以）【杀死靶细胞】（换言之，如果B，C，D……同时存在在靶细胞上，则关闭线路，不杀死靶细胞），那么情况会怎么样呢？要用与门把这么多非门串联起来，就会导致凋亡的时间被延后，这样的话“误杀”就难以避免。并联的非门怎么构建？tBID能拆分吗（拆分不影响效果吗）？这是一个需要做实验具体探讨的问题。
“与门”的扩建：多重靶向。
之前在第一个实验中，提到的“与门”，是同时识别两个蛋白。现在要求同时识别三个，甚至多个蛋白，即“若（因为）【靶细胞表达A】且【靶细胞表达B】且【靶细胞表达C】且……，则（所以）【杀死靶细胞】”。研究者认为有两种思路：
  1. αA synNotch-R-Tx → αB synNotch-R-Ty → αC CAR
    αA synNotch-R-Tx → αC CAR-sub1 + αB synNotch-R-Ty → αC CAR-sub2
即串联(in series)的方案和并联(in parallel)的方案。T指的是转录调控结构域——Tx和Ty是两个正交的转录调控因子。在并联与门中，αC CAR被拆分成两个部分，A和B的synNotch受体分别激活这两个部分的表达。只有这两个部分共同组成了完整的CAR，才能激活T细胞。——协同的思想，似乎在原则上同那些构建共刺激CAR的早期探索有异曲同工之处。
串联与门的具体实施：
αEGFR synNotch-R-Gal4-VP64 → αMET synNotch-R-LexA-VP64 → αHer2 CAR

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与K562细胞系共培养所得结果：

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串联：上面部分是体外实验，下面部分是体内实验，这里就不再介绍了，看图片就可以一目了然

并联与门的具体实施——严格来讲这里不是把CAR拆分成两半，而是CAR的识别过程拆分成两个部分（但本质基本一样）。一个αHer2 scFv与一个新表位(neo-epitope)标签相连，再构建一个能够特异性识别这个标签的CAR。

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串联与并联图解

并联与K562细胞系共培养所得结果：

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并联

看起来串联比并联的精准性要好一些，而并联出现一定的脱靶。作者猜测“可能是因为anti-MET synNotch受体的微弱表达”，但并未做实验深入研究。另外，为了比较αEGFR synNotch-R-Gal4-VP64 → αMET synNotch-R-LexA-VP64 → αHer2 CAR和αEGFR synNotch-R-LexA-VP64 → αMET synNotch-R-Gal4-VP64 → αHer2 CAR这两个线路的优越性，还补做了一个实验。（Gal4-VP64的转录刺激能力比LexA-VP64要强，所以颠倒顺序加以比较是有必要的，实验结果（下图）也确实证明这两者之间有所不同。）

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根据这个结果，可以推测前面一种线路能产生更强的αHer2 CAR表达，这对产生更强的T细胞激活和杀伤效果是有利的。

“或门”(OR gate)的构建：

其实或门本身并不需要synNotch参与，只需要构建两种或者多种靶向性的CAR就可以了。只有当或门与其他的逻辑门组合起来的时候，才显得必要。考虑一种三靶向的，与门和或门的结合，有两种情况：

  1. 1、若（因为）【【靶细胞表面有A】或【靶细胞表面有B】】且【靶细胞表面有C】，则（所以）【杀死靶细胞】。

  2. 2、若（因为）【【靶细胞表面有A】且【靶细胞表面有B】】或【靶细胞表面有C】，则（所以）【杀死靶细胞】。
第二个情况可以用已经讨论过的线路来构建。对于前面这种情况，又有两种思路：
  1. 1、αA TCR/CAR ← αC synNotch-R → αB TCR/CAR：有人已经试过
  2. 2、αA synNotch-R → αC TCR/CAR ← αB synNotch-R：作者在本文中尝试的，并且发现效果很好（见下图）。

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两个synNotch受体能实现的各种可能性：

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这种诱人的可能性（以及临床上的巨大潜力——如果进一步系统化成为一种工具箱的话）就是推动我为了区区这一项研究（当然，其实做了很多很多实验）而写一篇长文的原因。不过看起来这个系统还有一些问题是有待研究和探索的，（在上文已经指出，作为逻辑门构建的技术性问题；还有一些CAR-T细胞疗法当前面临的问题（比如靶点搜索的问题，synNotch-CAR-T细胞技术的应用化要走得远，无疑对我们对癌症靶点的认识提出了更高的要求）。）更多完善该系统的研究和它的应用化与发展，让我们拭目以待吧。
参考文献
1. Gordon WR, Vardar-Ulu D, Histen G, Sanchez-Irizarry C, Aster JC, Blacklow SC. Structural basis for autoinhibition of Notch. Nat Struct Mol Biol. 2007 Apr;14(4):295-300.
2. Jasper Z. Williams et al.Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors.Science370,1099-1104(2020).