为什么是小核酸药物？ 破局技术竞相角逐

小核酸药物布局哪些适应症？

小核酸药物靶点和可治疗疾病谱丰富，相关企业在行业发展早期主要从致病机理清晰、生物标志物明确并且缺乏有效疗法的单基因遗传性罕见病入手，以低风险策略推进早期临床管线，寻求快速的靶点验证和获批上市；

在化学修饰和GalNAc递送系统成熟后，逐步向肝相关心血管及代谢疾病等常见病（高胆固醇、乙肝、糖尿病、NASH）过渡，并探索肝外组织/器官靶向，长期布局中枢神经和眼科等疾病领域。

海外制药巨头普遍通过合作开发或并购方式切入小核酸赛道，扩展罕见病、心血管及代谢疾病领域版图。充分发挥小核酸药物多的优势，同时逐个击破面临的挑战，将给医药研发带来不可估量的益处。

小核酸药物的优势

小核酸药物相比现有疗法优势显著。小核酸药物相比现有的小分子和抗体药物具有靶点筛选快、研发成功率高、不易产生耐药性、更广治疗领域和长效性等优点，具有较大发展潜力。从数据来看，目前小核酸药物已在临床中初步展现出治愈疾病、替代现有疗法和填补空白适应症的能力，相继出现Leqvio 和Spinraza 等重磅品种。未来伴随技术持续进步，小核酸药物有望成为继小分子和抗体之后具有颠覆性的新主流疗法。

具体来讲，小核酸药物的优势主要有以下几点：

a.研发周期短，药物靶点筛选快。小分子和抗体药物需要识别某些蛋白质复杂的空间构象，因此需要大规模的药物筛选。而小核酸药物只需要锁定致病基因序列，并针对该基因序列进行设计及相应RNA片段的合成，因此其早期研发速度远远快于其他种类药物。 

b.不易产生耐药性。由于抗体和小分子主要通过调节细胞信号通路和代谢等方式发挥治疗作用，因此可能会由于补偿通路上调或抗原表达下降等因素产生耐药性，而小核酸药物直接调节上游基因表达，因此相对不易产生耐药性。

c.治疗领域更广。不受限于蛋白质的可成药性，理论上可以设计用于靶向任何感兴趣的基因，仅需要目标mRNA的序列信息，有望攻克尚无药物的遗传疾病和其他难治疾病。 

d.安全性。小核酸药物给药剂量小、频率低，是天然存在的生物过程，可被生物降解，细胞毒性和免疫原性低，在mRNA层面进行干预，对基因组无影响。

e.效果持久。通常来说，小分子药物的体内半衰期以小时计算，抗体药物的体内半衰期以天/周计算，而由于小核酸药物可以在体内被循环多次使用，因此能降低给药频次，在体内的半衰期可以按照月来计算，对很多疾病尤其是慢病的治疗具有巨大的临床价值。 

f.临床研发成功率较高。由于小核酸药物作用机制明确，通过与mRNA完成Watson–Crick碱基配对来实现其功能，无需契合蛋白质复杂结构，因此研发成功率相对较高。参考Alnylam公司的研发成功率，I期到 III期成功率达到59.2%，相比靶向药和整体医药的研发成功率高5倍。

图注：Alnylam RNAi药物研发成功率较高

小核酸药物仍具开发挑战

化学修饰和递送系统成主流解决方案

目前，基于核酸药物的治疗仍面临许多挑战，包括脱靶效应、疗效、半衰期、递送、免疫应答和毒性等。尽管许多基于寡核苷酸的药物通过序列特异性相互作用和/或触发特异性酶活性与其靶mRNA结合，但它们的脱靶效应始终存在并且是浓度依赖性的。而通过核酸药物的不同化学修饰或有效递送系统的应用来提高其对核酸酶的稳定性，可能会牺牲核酸药物的功效。对核酸药物及其递送系统进行最佳化学修饰已经是一种必要。

除了核酸药物本身的挑战外，核酸药物作为聚阴离子生物分子，由于其大小和负电荷，无法自行跨细胞膜扩散。以siRNA为例，临床上siRNA递送存在若干障碍，包括血管内降解、组织外显性和特异性、细胞内运输和细胞外基质。未修饰的核酸在循环中的半衰期较短，因为容易血管内降解和被肾脏快速清除。目前已经实现了核酸（尤其是寡核苷酸）的许多传统化学修饰，例如PS键，25′-OMe，2′-MOE，2′-F和LNA，这些化学修饰的核酸药物可以增强其在体内的药代动力学特性，大大增加寡核苷酸对核酸酶的抗性，增强结合亲和力以及降低免疫反应。

核酸纳米颗粒具有应对基于核酸的体内治疗挑战的潜力。基于纳米颗粒的基因递送可以改善循环中核酸的半衰期，并保护核酸药物免受血管内降解。同时，纳米颗粒的材料、形状和表面功能化对核酸包装和体内系统递送也有很大的影响。

特异性组织积累、细胞内化和核酸内体逃逸是体内基于基因的治疗的常见挑战。因此核酸药物的有效递送系统必须包含以下特征：（1）核酸药物对不同核酸酶的稳定性增强，（2）不刺激先天免疫系统，（3）预防肾脏清除，（4）从血流运输到特定组织中的靶细胞，（5）高负载效率和高效的内体逃逸。

核酸药物的化学修饰旨在用于靶标特异性体内递送，提高药物的靶向性与递送性。核酸药物有许多化学修饰方式，包括骨架、碱基和糖修饰和引入非天然核苷酸等。

3.1.1胆固醇修饰的siRNA

胆固醇与 siRNA (Chol-siRNA)的共轭可以增加 Chol-siRNA 轭合物与裸 siRNA 相比的净亲脂性，并改善其细胞摄取和沉默效果。全身给药后，化学稳定的 Chol-siRNA 通常与脂蛋白(如血液循环中的 HDL，LDL)相关联形成脂蛋白颗粒。目前的研究表明，通过静脉注射和胆固醇修饰后，Chol-siRNA 的体内药代动力学特性显著改善(如半衰期，清除率) ，并且胆固醇修饰也增加广泛的组织生物分布。

图注：胆固醇或亲脂性siRNA偶联物

3.1.2 烷基链修饰的siRNA

亲脂性siRNA是一组用疏水性脂质（如胆汁酸）和长链脂肪酸修饰的治疗性siRNA。亲脂性siRNA的细胞摄取和治疗性基因沉默活性主要取决于siRNA与亲脂性残基之间的烷基链长度。据报道，亲脂性siRNA与脂蛋白颗粒的结合功效或亲和力与体内siRNA的细胞内摄取和治疗沉默活性相关。最佳的摄取和沉默活性是含有6至10个碳原子的烷基接头的Chol-Cx-siRNA。较长的烷基接头改善了siRNA细胞的摄取，但降低了其对靶基因的沉默效率。

3.1.3 维生素E修饰的小核酸

维生素E（VitE，生育酚）是一种低毒、必需的亲脂性天然抗氧化剂，不能在人体细胞中合成。VitE修饰已被证明可以改善核酸药物在体外和体内的基因递送，类似于胆固醇修饰。两亲性VitE 修饰的寡核苷酸由于疏水性 VitE 头部和寡核苷酸的亲水性尾部而具有较大的表面积。VitE修饰的寡核苷酸可以与细胞表面的受体蛋白相互作用，以进行细胞类型特异性捕获和递送。修饰的ASO的疏水生育酚可以与膜细胞内细胞器或细胞内蛋白结合，并协助ASO进入细胞。然而，生育酚与结合蛋白的结合极大地抑制了反义寡核苷酸对靶向mRNA的获取和/或RNase H和ASO/mRNA双链体的相互作用，导致ASO基因敲低的丧失。但是具有4-7个可降解接头的Toc-ASO显着增加了体内的全身基因递送和治疗沉默活性。

图注：VitE-siRNA偶联物

3.1.4 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）修饰的寡核苷酸药物

GalNAc是一种众所周知的肝脏靶向配体，对去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）具有高亲和力。用单、二、三或四GalNAc修饰寡核苷酸可以提高寡核苷酸药物对肝细胞的递送效率。GalNAc修饰的寡核苷酸可以通过ASGPR介导的内吞作用特异性递送到肝细胞，从而显著增强肝细胞中靶基因表达的抑制。GalNAc偶联的siRNA/ASO药物通过皮下注射给药（静脉给药会被肾脏迅速清除），延长参与循环时间，可以做到数月至半年给药一次。

图注：GalNAc 寡核苷酸偶联递送至肝细胞

3.1.5 动态聚偶联（DCP）寡核苷酸

第一代动态聚偶联物（DPC 1.0）系统由具有氨基和丁基侧链的可逆、两亲性和内溶性聚合物（PBAVE聚合物）组成，用掩蔽剂（如PEG试剂和GalNAc配体）通过酸不稳定的羧基二甲基马来酸酐（CDM）键修饰PBAVE的氨基。第二代DCP（DCP 2.0）具有通过CDM键与掩蔽剂连接的阿米利丁样多肽（MLP）骨架，DCP的CDM键在内体的酸性环境中容易降解，导致掩蔽剂的释放和骨架的质子化。DPC 作为一种高效、特异的非病毒载体被广泛应用于肝细胞的 siRNA 体内递送，具有从内体释放 siRNA 的优点。

图注：DCP-siRNA 偶联物

3.1.6 核酸适配体-寡核苷酸偶联物

细胞类型特异性适配体通常被称为“化学抗体”，具有易化学固相合成，物理和热稳定性，无免疫原性或低免疫原性的优点。核酸适配体除了本身可以作为核酸药物开发，还可以与其他核酸药物结合进行靶向给药。适配体-siRNA/shRNA/miRNA 嵌合体由适配体和通过烷基部分连接的治疗性寡核苷酸(siRNA，miRNA 或 shRNA) 、生物素-链霉亲和素相互作用，互补低聚物杂交或粘性桥组成。具有前列腺特异性膜抗原(PSMA)的适配体-siRNA 嵌合体是第一代靶向PSMA表达细胞的嵌合RNA适体，并抑制PLK1和BCL2基因表达。两个生物素化的PSMA适配体和两个生物素化的siRNA 独立结合到链霉亲和素的四个结合位点，并且适配体-siRNA 复合物被特异性地递送到表达PSMA 的细胞，使得有效的层粘连蛋白A/C基因沉默。

图注：细胞类型特异性RNA适配体作为递送剂

3.1.7 肽或抗体修饰的寡核苷酸

为了实现核酸药物向特定细胞或组织的靶向递送，研究者们还采用不同的靶向肽或抗体与核酸药物偶联，其中环状RGD（cRGD）肽是基因递送应用中最相关和最常用的肽之一。cRGD与αvβ3整合素保持高特异性亲和力，αvβ3整合素通常在许多癌细胞（如黑色素瘤，脑肿瘤和乳腺癌）表面过表达。除此之外抗体也是手段之一，核酸药物与某种抗体的偶联使核酸药物能够靶向递送到特定的细胞或组织。

图注：RGD修饰的寡核苷酸

纳米颗粒的研发也用于核酸药物递送。

3.2.1 脂纳米颗粒（Lipid nanoparticle，LNP）

包封在脂质体中的siRNA在血液中通常比裸siRNA更稳定，这增强了siRNA的安全性、良好的耐受性和药代动力学。脂质体的表面可以与PEG试剂和各种靶向配体进一步结合。并且脂质体的组成可以通过插入后的方法用其他脂质修饰。脂质体的这些功能化，都是为了解决目前基因传递的关键挑战，如长血液循环、靶组织中的特异性细胞内摄取和高效的内体逃逸等。核酸药物递送存在四种类型的脂质体结构，包括脂复合物、稳定核酸脂质颗粒（SNALP）、脂多复合体和膜核纳米颗粒（MCNP）。SNALPs被认为是临床应用中核酸药物，尤其是siRNA药物的有前途的全身递送。

目前核酸药物包封在阳离子脂质体核心中主要有两种方法。一种方法是通过静电相互作用将阳离子脂质（如 DOTAP、DOTMA、DOSPA 和 DMRIE）、PEG 脂质、胆固醇和磷脂酰胆碱与核酸水溶液形成的干燥和薄脂膜进行再水化；另一种方法是用冻干基质法进行脱水-再水化过程。

图注：四种脂质体结构

3.2.2 多肽纳米颗粒（Polypeptide Nanoparticle，PNP）

由组氨酸/赖氨酸聚合物（HKP）组成，可聚集为纳米颗粒，封装并保护10k~100k siRNA通过NRP1受体递送至靶组织和细胞；进入细胞后，通过组氨酸介导的质子化提升内涵体逃逸效率，将siRNA有效载荷释放到细胞质中的作用位点。

图注：PNP结构

3.2.3 聚合物纳米粒子（Polymeric nanoparticles）

与中性亲水性PEG聚合物（PEG-siRNA偶联物）偶联的siRNA被证明可用于全身基因传递。

图注:用于siRNA递送的siRNA-聚合物偶联物

3.2.4 金属纳米粒子（Metallic nanoparticles）

金属纳米颗粒由于毒性相对较低、生物相容性好、递送效率高、表面易官能化等特点，也被用作基因递送载体。寡核苷酸可以通过化学修饰和静电相互作用附着在金属纳米颗粒的表面。金属纳米颗粒与寡核苷酸的功能化方法包括盐老化、降低pH和冷冻。金纳米颗粒（Au NP）已被证明可在用干冰冷冻2分钟后能够与末端硫醇修饰的DNA进行有效偶联。

图注：通过冷冻将DNA附着在Au NPs上

3.2.5 电荷反转纳米粒子（Charge-reversed nanoparticles）

电荷反转的纳米颗粒由一组对细胞内物种敏感的阳离子聚合物形成。聚合物的电荷从正电荷反转为负电荷导致缩合治疗寡核苷酸的释放。已经证明电荷反转纳米颗粒是一种有效的体外和体内基因递送剂。

3.2.6 寡核苷酸纳米颗粒（Oligonucleotide nanoparticles）

具有三维结构的自组装寡核苷酸纳米颗粒（ONP）在体内成像和递送方面具有潜在的生物学应用。已有报道由自组装的合成DNA寡核苷酸形成的DNA笼是纳米级四面体结构，用于在人胚胎肾（HEK）细胞中递送和释放货物。

3.2.7 RNA转录纳米颗粒（RNA transcript nanoparticles）

RNAi微海绵是一种新的siRNA载体，含有许多多聚体发夹RNA片，这些RNA自组装成核酸复合物。在带正电荷的PEI存在下，RNAi微海绵可以进一步缩合成致密的纳米颗粒，以便在体外或体内高效递送siRNA。在被细胞吸收后，RNAi微海绵中的发夹RNA在RNAi途径中被Dicer转化为siRNA。

目前，Alnylam已建立肝外递送配体发现平台，布局小分子/脂类（C16进行CNS递送）、多肽（收购PeptiDream，针对特定受体筛选/优化/合成候选多肽序列）、抗体等配体。此外，Ionis的LICA（Ligand-Conjugated Antisense）、Arrowhead的TRiM（Targeted RNAi Molecule）等平台也通过连接能够特异性结合特定组织细胞表面受体的配体探索组织靶向性给药。

小核酸药物带来全新的治疗范式，小核酸靶点和可治疗疾病谱丰富，在化学修饰和GalNAc递送系统成熟后，治疗方向逐渐从罕见病向肝相关心血管及代谢疾病等常见病（高胆固醇、乙肝、糖尿病、NASH）过渡，并探索肝外组织或器官靶向，长期布局中枢神经和眼科等疾病领域。递送系统的不断成熟催促着小核酸药物的治疗版图不断扩展，对于开发有效的临床应用核酸药物发挥至关重要的作用。

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