导读：自复制RNA(saRNA)由于其复制特性，在远低于常规mRNA的剂量下可实现相同水平的蛋白表达，可以显著降低其生产成本以及由剂量带来的不良免疫原性，因此是一种理想的疫苗/药物平台。目前，saRNA的开发方向包括saRNA疫苗用于传染性疾病、细菌病原体、寄生虫预防和癌症治疗、以及saRNA药物用于蛋白替代疗法，其前景相当广阔。
从新药设计和开发角度看，saRNA和常规mRNA都属于体外转录（IVT）合成的RNA，也称为IVT RNA。saRNA有以下序列特征：①saRNA包含常规mRNA序列组成元件：5’ UTR、目标蛋白编码区（CDS）、3’ UTR和poly(A)尾；②saRNA的特有序列元件包括：位于5’ UTR下游的alpha病毒（甲病毒）等来源的非结构蛋白（nsp）编码序列以在细胞内表达RNA复制酶，以及目标蛋白编码序列上游的亚基因组启动子序列（SGP）。

 

下文中菌菌将结合首款上市的saRNA疫苗，即由CSL与Arcturus therapeutics联合开发的ARCT-154，解析saRNA的序列组成。
01自复制RNA(saRNA)技术的发展历程

 

相比常规mRNA，自复制RNA(saRNA)包含复制酶编码序列，具有在宿主细胞内自我复制的能力，导致靶蛋白表达增加，这一特性使其成为疫苗开发和疾病治疗的有前途的工具。saRNA技术的发展依赖于体外制备mRNA的突破。自1961体外制备得到mRNA，1990年Wolff在小鼠中递送裸mRNA进而表达出蛋白，以及脂质体等递送技术的日益发展与完善，都极大地推动了长链编码RNA技术的发展。

 

而真正关于saRNA技术的突破性进展，发生在2012年，Geall等人在PNAS上发表题为“saRNA疫苗的非病毒递送”，自此研究人员开始通过体外转录制备saRNA。而后随着脂质纳米颗粒（LNP）递送系统的成熟，mRNA疫苗在新冠疫情中的重大贡献，saRNA作为mRNA的升级版本也得以快速发展。

 

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图1 saRNA技术发展历程

 

02 自复制RNA(saRNA)的序列组成元件

 

SaRNA与mRNA疫苗/药物都属于长链编码RNA，通过体外转录（IVT）的方式制备。其序列组成均包含5’ UTR、目标蛋白编码区（CDS）、3’ UTR和poly(A)尾，以模拟生物体内天然mRNA，降低先天性免疫反应。

 

此外，除上述传统线性mRNA必备元件外，saRNA的序列组成包括以下两个特有部分：①一是alpha病毒（甲病毒）等来源的非结构蛋白（nsp）编码序列，位于5’ UTR的下游；nsp通常包括nsp1-4，其作用是在细胞内表达非结构蛋白，发挥RNA复制酶的功能；②二是亚基因组启动子序列（SGP），位于目标蛋白编码序列的上游。

 

SaRNA独特的序列结构，赋予其RNA复制子的生物学功能。mRNA 复制酶首先以正义链RNA合成出互补的负链 RNA中间体，接着，以后者为模板合成出两个不同的正链RNA。第一条正链RNA是原始全长基因组RNA的拷贝；第二条正链RNA是大量的编码异源靶基因的亚基组RNA，这也是saRNA能够以低剂量实现高水平持久靶蛋白表达的原因。

 

图2: 自复制RNA(saRNA)与常规mRNA序列示意图

 

03 首款上市saRNA疫苗ARCT-154的序列解析

 

ARCT-154是首款上市的自复制RNA(saRNA)疫苗，由CSL与Arcturus therapeutics联合开发，已获日本厚生劳动省（PMDA）批准上市。

 

据报道，ARCT-154疫苗由脂质纳米颗粒（LNP）包封的saRNA组成。其LNP脂质组分包括阳离子脂质ATX-126、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。其saRNA序列组成如下（5’-3’）：

 

Ÿ   ARCT-154的第一个元件为由G组成的帽结构；

 

Ÿ   ARCT-154的5’UTR，来源于α病毒委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）；

 

Ÿ   ARCT-154的复制酶来源为VEEV非结构蛋白编码序列nsp1、nsp2、nsp3、nsp4；这里值得注意的是，由于nsp1-4也是saRNA的编码区域，因此ARCT-154开发人员针对VEEV nsp1-4进行了密码子优化；

 

Ÿ   ARCT-154的亚基因组启动子序列（SGP）同样来源于VEEV基因组，同时插入了一段Kozak序列；

 

Ÿ   ARCT-154的抗原编码基因是新冠病毒SARS-Cov-2刺突蛋白（S蛋白）D614G突变序列，目标蛋白编码区同样进行了密码子优化。

 

Ÿ   ARCT-154的3’UTR，来源于α病毒委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）；

 

Ÿ   ARCT-154的polys(A)采用了分段式的poly(A)，长度约130bp。

 

04 小结

 

简单理解，ARCT-154的序列基本是基于α病毒VEEV基因组进行设计，整体思路为：将VEEV的结构蛋白编码序列替换为目标抗原，即新冠病毒S蛋白突变体；随后又进行了细节的优化，包括基于IVT RNA的非编码序列、poly(A)序列优化等原则添加了Kozak序列、并进行了poly(A)的优化。同时出于分子生物学操作等考虑添加了适当的酶切位点。

 

随着ARCT-154的上市，不仅作为IVT RNA技术的革新，同时也在一定程度上缓解了市场对saRNA生产工艺稳定性和质量稳定性方面的忧虑。基于其“低剂量高表达”的独特优势，saRNA有望在传染病预防、肿瘤治疗、视网膜疾病治疗领域发挥重要价值。 
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参考文献：

 

[1] Blakney AK, Ip S, Geall AJ. An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vaccines (Basel). 2021 Jan 28;9(2):97.

 

[2] Schmidt C, Schnierle BS. Self-Amplifying RNA Vaccine Candidates: Alternative Platforms for mRNA Vaccine Development. Pathogens. 2023 Jan 13;12(1):138.

 

[3] Comes JDG, Pijlman GP, Hick TAH. Rise of the RNA machines - self-amplification in mRNA vaccine design. Trends Biotechnol. 2023 Nov;41(11):1417-1429.

 

[4] Perenkov AD, Sergeeva AD, Vedunova MV, Krysko DV. In Vitro Transcribed RNA-Based Platform Vaccines: Past, Present, and Future. Vaccines (Basel). 2023 Oct 16;11(10):1600.

 

[5] Oda Y, Kumagai Y, Kanai M, Iwama Y, Okura I, Minamida T, Yagi Y, Kurosawa T, Greener B, Zhang Y, Walson JL. Immunogenicity and safety of a booster dose of a self-amplifying RNA COVID-19 vaccine (ARCT-154) versus BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine: a double-blind, multicentre, randomised, controlled, phase 3, non-inferiority trial. Lancet Infect Dis. 2024 Apr;24(4):351-360. doi: 10.1016/S1473-3099(23)00650-3.