当我们谈论“衰老”这个词时，浮现在脑海中的可能是皱纹、白发、器官功能退化……但在细胞层面，衰老远比想象中复杂。衰老的细胞并非简单地停止分裂，它们的功能状态千差万别，甚至在同一种细胞类型中，也存在诸多“衰老亚型”。有的衰老细胞分泌炎症因子扰乱组织微环境，有的则保持静默，甚至维持局部稳态。
过去，科学家们往往通过单一指标来界定细胞是否“衰老”，比如细胞周期停滞或β-半乳糖苷酶阳性染色。然而，这种粗略的分类方法很难解释为什么一些衰老细胞促进炎症，而另一些却无声无息地存在。于是，科学家开始追问：衰老细胞之间是否存在功能上的“亚型”？如果有，我们该如何识别它们？
近日，来自哈佛大学医学院与麻省理工的研究团队抛开传统的分子标签，选择了一种更为“直观”的方式——通过单细胞形态学，来解码细胞衰老背后的异质性。他们发现，即使是外形细微的差异，也可能映射出深层次的生物学功能差别。换句话说，细胞长什么样，可能就决定了它的“命运”。该研究题为“Single-cell morphology encodes functional subtypes of senescence in aging human dermal fibroblasts”，发表在Science Advances杂志。
图1：标题
研究背景
细胞衰老历来被视为一种稳定的增殖停滞状态，伴随p16、p21等细胞周期抑制因子的上调以及炎症因子的分泌。然而，近年来的研究不断揭示：衰老并非一个均质的二元过程，而是具有高度异质性的生物学状态，其表型可因诱导方式、组织环境乃至个体年龄而异。为突破传统依赖少数分子标志物、难以捕捉细胞功能差异的局限，该研究作者提出了一种基于单细胞图像的衰老表型分类框架——SenSCOUT。
该系统结合高内涵显微成像与深度学习模型（Xception架构），从细胞F-actin及核DNA染色图像中提取特征，构建“衰老评分”，并识别出11类形态亚型，其中3类（C7、C10、C11）表现出典型衰老特征，验证包括多标志物表达、细胞形态改变等。进一步在50名20至89岁供体来源的原代真皮成纤维细胞中验证后发现，亚型C10与年龄高度相关，提示其可能为衰老过程中累积性、年龄依赖性最强的细胞群体。
更重要的是，这些亚型在接受经典Senolytic治疗（Dasatinib+Quercetin）时展现出显著的功能响应差异，表明衰老细胞对干预的敏感性与其亚型身份密切相关。该研究为衰老异质性的定量刻画与精准干预提供了方法学基础，也为衰老相关疾病的个体化治疗奠定了图像学与算法支持的新范式。
研究方法及结果
为全面刻画不同诱导条件下的细胞衰老特征，研究团队选用来自23岁与89岁健康供体的原代真皮成纤维细胞，分别代表“年轻组”和“老年组”，并通过五种诱导方式（包括BLEO、DOX、ATV、H₂O₂处理及连续传代）诱导衰老。
细胞经诱导后培养八天，再接种于胶原I包被的玻璃底培养皿，固定并染色。染色标记包括细胞核染料Hoechst 33342、F-actin标记Phalloidin、以及多个衰老相关蛋白（p21、LMNB1、HMGB1、p16或β-半乳糖苷酶）。所有细胞图像通过CellProfiler自动分割，结合自建数据处理流程进行质量控制与特征提取，最终获得超过5万个单细胞样本，涵盖细胞与核形态特征以及多重衰老标志物表达，构建出一个覆盖不同年龄与诱导方式的衰老图像数据库。
图2：细胞和核形态是体外细胞衰老的生物标志物。
研究通过评估细胞增殖停滞、衰老标志物表达、SASP分泌物变化及细胞与核形态特征，系统验证了五种诱导条件下的衰老表型，发现不同诱导方式和年龄影响衰老程度，尤其是核形态特征与衰老密切相关，为后续基于单细胞图像识别功能性衰老亚型奠定基础。
之后研究人员建立了一个基于单细胞图像分析的衰老表型分类框架，通过对不同诱导条件下的人皮肤成纤维细胞进行高内涵成像、形态特征提取和聚类分析，识别出11个具有代表性的形态亚群。
图3：形态编码衰老表型内的异质性。
UMAP显示未诱导细胞集中于图左下方，而衰老细胞则分布于图右侧，表现出细胞体积增大、形态线性化等趋势。不同诱导方式虽存在差异，但在形态分布上也有重叠区域。进一步聚类显示，诱导方式与特定形态亚群显著关联，同时诱导组整体表现出更高的形态异质性。该分析为衰老亚型的功能探索奠定基础。
为了全面描绘这些衰老标志物在不同生物条件下的表达特征，研究团队采用多重染色策略，在单细胞水平上逐一评估五大衰老标志物，并结合高通量成像与UMAP降维分析，描绘了“衰老细胞地形图”。结果显示，表达高水平p21、p16和β-gal、但HMGB1和LMNB1表达较低的细胞，主要集中在图谱右侧、体积较大的细胞群中，提示其典型衰老特征。而部分细胞则表现出中间态，或许正处于向衰老过渡的“临界点”。这一发现再次强调了：即便不看分子水平，仅从细胞核与胞体形态特征，也能识别出衰老的“蛛丝马迹”。
之后研究团队利用Xception深度学习模型，通过细胞F-actin和核DNA的原始图像训练模型，为每个细胞生成0到1之间的衰老评分。模型在验证集上准确率达89%，ROC曲线AUC为0.95，表明其在无监督条件下准确识别衰老表型。
图4：机器学习和计算技术识别衰老的形态亚型。
进一步分析显示，评分与细胞核面积等参数高度相关，且单独使用细胞或细胞核图像模型表现相近，证明二者均能有效识别衰老。此外，评分与基于五种衰老标志物定义的簇高度一致，特别是C7、C10和C11簇显示高评分（>0.9），被定义为三种“衰老亚型”，表现出与诱导方式相关的衰老差异性。
此外，研究发现，DOX诱导下细胞逐步进入衰老状态，C10和C11亚型细胞比例随时间上升；而H2O2诱导呈双相变化，早期进入衰老后部分细胞未转化并恢复增殖，导致晚期衰老特征减弱，说明不同诱导剂引发的衰老进程存在显著差异。
图5：基线形态比实际年龄更能反映衰老易感性。
随着年龄增长，衰老细胞的积累显著增加，但衰老诱导的易感性与年龄的关系更复杂。虽然年龄与基础衰老评分呈正相关，但年龄与衰老诱导后的评分无显著相关性，基础评分可预测衰老易感性。
总结
总之，本研究开发了一种基于单细胞技术的衰老表型分类方法（SenSCOUT），通过机器学习识别并分类了衰老细胞的异质性亚型。结果表明，衰老亚型的表型依赖于诱导方式和时间，衰老细胞的表型在不同条件下呈现异质性，且不同亚型对衰老治疗的反应不同。尽管该方法主要在体外验证，未来的研究需将其应用于体内复杂组织，进一步探索衰老亚型的生物学意义及潜在的精准治疗应用。
来源：Kamat P, Macaluso N, Min C, Li Y, Agrawal A, Winston A, Pan L, Starich B, Stewart T, Wu PH, Fan J, Walston J, Phillip JM. Single-cell morphology encodes functional subtypes of senescence in aging human dermal fibroblasts. bioRxiv [Preprint]. 2024 May 16:2024.05.10.593637. doi: 10.1101/2024.05.10.593637. Update in: Sci Adv. 2025 Apr 25;11(17):eads1875. doi: 10.1126/sciadv.ads1875. PMID: 38798365; PMCID: PMC11118441.
撰写：Catherine
编辑：小饼干
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