药物质量研究分析方法的高效建立及典型案例分享

中国化工企业管理协会医药化工专业委员会

各有关单位：

随着这几年来集采政策落地实施及行业内卷带来的冲击，仿制药项目举步维艰，小分子新药、寡核酸、多肽尤其是GLP-1最近几年极为火爆而且还在持续走红。伴随着药品审评尺度的越来越严，发补愈发频繁，药物的质量再次受到业界的关注，药物研发中质量研究依赖于分析方法和质量标准的建立。药物质量研究分析中常遇到各类问题，其中不少的问题是出在分析方法中，需快速解决，但实际排查往往耗时费力，作为工艺开发的“眼睛”，可靠的分析方法直接或间接影响研发到生产的全生命周期（如能否成功转移至甲方或至工厂），其重要性不言而喻。

日常检测过程中，遇到各种问题，如保留时间飘移，峰裂分、峰拖尾、峰前延、U型峰、主峰前后基线抬起等，这些都归咎于分析方法开发的缺陷，出现这种情况的原因主要是分析人员在方法开发时，对化合物的认知不够，有机化学及色谱理论缺乏、实践经验欠缺等。随着ICH Q14中AQbD理念的问世，分析方法变异性、稳健性周期性再次上升到一个更高的层次。NMPA于2024年5月28号第65号文再次提到申ICH Q14了两种开发方式-基础（即传统）方式或者增强方式，由此可见按照ICHQ14提供的参考方式来进行分析方法开发是大势所趋。

关于基因毒性杂质研究的挑战与误区，在早些年前，基因毒性杂质研究历史事件（如罗氏奈非那韦召回、华海缬沙坦事件）成为药物安全的焦点话题，尽管LCMSMS/GCMS等高灵敏度的仪器已普及应用到痕量杂质的检测，但基因毒性杂质方法开发仍面临假阳性、回收率不佳等难题。部分分析人员还存在认知误区，认为高灵敏度的仪器即可解决问题，忽视了方法开发过程中的一些挑战，另外还有部分同行有这样或那样的误区：

a:原料药溶解性很差，认为不溶解也是可以的，那我通过离心取上清液或过滤后进样不就可以了么？ 答案是否定的，要规避假阴性的风险发生，样品不能溶解即使加标回收率做出来很好，也无法确保不存在假阴性，所以原料药是必须要经历完全溶清的这一均相过程。制剂中原料药（制剂中主成分）溶解即可。

b：基毒杂质方法学验证，回收率只能50%，认为可以接受，坦率地讲这样方法不能说绝对不行但多少是有问题的（好比迟到总比不来好）。
   基因毒性杂质方法开发中遇到最突出的问题是加标回收率不合格，如限度浓度的对照品溶液没问题，而样品加标溶液进样后发现目标峰没了或目标峰跟限度的对照品溶液比响应差了很大导致回收率为零或偏差很大，除此之外基因杂质稳定性不好也是难点之一，有时候可能需要衍生，基因毒性杂质与主成分溶解性差异很大如叠氮根用离子色谱法做灵敏度一般是够的，可往往因主成分水溶性差，就不能直接上IC,这时可通过一些样品前处理手段如:液液萃取LLE、SPE等,常被应用到基因毒性杂质方法开发中。

杂质研究贯穿于药物研发全生命周期整个过程，从早期到工艺优化一直商业化上市都需要关注。当小试或放大等出现难以除去杂质，可通过富集或制备等手段进行研究。制备过程中常面临样品溶解性差、杂质不稳定等问题。杂质制备完后，需借助MS和NMR进行结构确证，确证后还需结合工艺溯源杂质产生的机理，这一过程不仅涉及分离分析技术，更需要深入理解工艺化学，才能建立有效的控制策略。

气相色谱分析方法相对于液相而言它主要是用在控制ICHQ3C的溶剂残留杂质，或没有紫外吸收（而又没有特殊检测器ELSD /CAD）结构分析，虽说GC的方法开发没有HPLC那么复杂，但是GC中出现一些未知峰（尤其是样品基质引入的）也是令企业分析工作者非常头疼的事儿，未知峰如何进行处理？除了GCMS外有没有更好的方法去解决呢？

为了企业分析人员解决HPLC、GC、MS方法开发中的实际问题，我单位特邀资深专家开展专题培训，通过实际工作中典型案例剖析，揭示分析方法开发中常见隐患与解决方案，助力一线分析人员提升实战能力，规避技术风险，从而避免或少走一点弯路，提高工作效率。希望通过本次交流能切切实实地提升分析人员在方法开发方面及解决复杂问题时的能力，让其不再迷茫、不再徘徊。

本次培训对于学员的要求：至少有三或五年以上的小分子药物分析经验，具备化学分析、仪器分析、基础有机化学等知识储备。建议阅读学习《基础有机化学》、《现代液相色谱技术导论》、《无机化学》、《制备色谱分离技术》、样品预处理技术等相关书籍（有机化合物的波谱解析如工作中有涉及到可进行学习了解）。

本次讲座交流的张老师

板块一：化合物结构、物化性质与分析方法相互之间的关系

1.1如何从化合物结构判断其极性相对大小

化合物的极性判别的两个常见参数

1）极性与logP

2）极性与logD曲线

极性与TLC色谱，logD与一般反相色谱之间的关系

1.2如何根据化合物的结构判断该化合物是显酸性、碱性还是酸碱两性

1）化合物的酸碱性判断及理论依据

2）化合物的酸碱性与pKa之间的关系

3）化合物的酸碱性对于RP-HPLC、RP-IPC方法开发,如何选择流动相A相的pH值有一定的指导意义。

4）电子效应对于化合物的酸碱性及pKa的影响

1.3化合物结构、酸碱性极性与分析方法的关系（这里主要涉及rp-HPLC）

从化合物结构本质来揭示分析方法（化合物中常见的一些基团及相互之间可能的互变）

板块二、色谱基础理论

2.1色谱基础理论

2.1.1色谱法分类原理

2.1.2塔板理论概述

2.1.3速率理论概述

2.1.4色谱分离的各种作用力（施耐德疏水减法方程）

2.2气相色谱概述

2.2.1气相色谱在实际工作中常见两种进样方式

2.2.2气相色谱柱的简述

2.2.3气相检测器

板块三：液相色谱分析方法开发程序与案例分享

3.1反相液相色谱分析方法开发以及案例

3.1.1反相液相色谱分析方法开发可能涉及到的基础知识

a:反相色谱柱的介绍

b:反相流动相的简述

c:影响反相色谱分离的因素

3.1.2反相液相色谱分析方法开发一般程序（主要是有关物质）

列举有关物质分析方法开发的一般思路（仅仅供参考）

色谱柱筛选系统+流动相筛选系统

3.1.3反相液相色谱分析方法案例分享

A）碱性化合物遇到拖尾问题如何解决？

一般脂肪胺或季铵碱拖尾如何设计流动相

极性大的碱性流动相的选择或固定相的选择

无紫外吸收脂肪胺的分析方法的开发（CAD检测器）

B）极性大化合物没用保留如果进行分析方法开发？

C）反相离子对色谱应用中遇到的种种困惑？

  浅谈离子对色谱及离子交换色谱的原理

D）峰型异常、不出峰或易互变的案例

E）化合物潜在不稳定或易降解的案例

F）需要衍生处理的案例

G）有机化合物异构现象分类及分析方法开发

位置异构体(对/非对映异构体除外)或结构类似化合物分离

3.2手性异构体的液相色谱分析方法开发以及案例

3.2.1对映异构体手性分离的基础

3.2.1.1手性分离的基本原理

3.2.1.2手性固定相（色谱柱）的介绍

3.2.1.3手性流动相

3.2.1.4对映异构体分析方法开发的一般思路

3.2.1.5对映异构体分析方法的几个案例

3.2.2非对映异构体通常不需要手性环境分离

3.2.2.1固定相的选择

3.2.2.2流动性的选择

3.3液相色谱分析方法导致峰异常的常见原因之一（溶剂效应）

3.3.1溶剂效应导致峰型异常

3.3.2解决溶剂效应一些常规思路

板块四：基因毒性杂质方法开发程序与案例分享

4.1溶剂性质、样品基质和目标物的溶解

4.2样品前处理的手段（如LLE/SPE/衍生化）

4.3基因毒性杂质分析方法开发一般思路

4.4典型基毒杂质方法开发的案例分享

板块五：制备分离在杂质研究中的应用

5.1杂质或其它组分提纯的手段

5.2手性对映异构体杂质的分离纯化

5.3 制备分离中的疑难点及案例分享

5.4 结构确证的相关表征工作(如MS/NMR解析)及杂质溯源

板块六：液相中未知峰(或鬼峰)的排查

6.1如何对未知峰(或鬼峰)进行排查

6.2残留峰的案例分享

板块七：气相色谱分析方法开发程序与案例分享

7.1气相色谱分析方法开发一般策略

7.2气相色谱分析方法中遇到常见的问题

7.3气相色谱溶剂残留中未知峰如何处理？

板块八：多肽药物质量研究中方法开发及小核酸方法开发浅谈

8.1多肽质量研究及分析方法开发

 8.1.1 多肽的分类及杂质谱

 8.1.2 简述多肽的质量研究

 8.1.3 阴离子分析与有关物质分析方法开发

8.2 小核酸质量分析析

8.2.1 小核酸杂质谱

 8.2.2 简述小核酸的质量研究

 8.2.3 小核酸有关物质分析方法开发及其难点

板块九：ICHQ14分析方法开发及小结

9.1Q14两种开发方式

9.2分析方法全生命周期与变更管理

9.3通过案例进行回顾小结