癌症免疫治疗中的T细胞景观

一、肿瘤微环境中的TILs

1. T细胞状态

肿瘤部位内T细胞浸润的程度长期以来被认为是癌症患者的重要预后因素，甚至在免疫检查点阻断成为癌症治疗武器库的组成部分之前就是如此。事实上，关于免疫学“冷”与“热”肿瘤的简单二分法，大量研究一致表明，肿瘤内或其边缘存在T细胞，或肿瘤内检测到细胞毒性活性，与改善的临床结局相关。最近，对不同癌症类型中单个TIL以越来越精细的粒度进行的表征提供了证据，表明TME内的T细胞可以存在于一系列不同的表型细胞状态中，每种状态由不同程度的分化、细胞毒性、增殖和干性潜能定义。

在不同肿瘤组织类型中，“热”TMEs主要被抗原经历过的CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润，这些细胞源自幼稚前体细胞在遭遇和识别其同源抗原后经历活化和分化。在TME内捕获的抗原经历过的细胞可大致区分为记忆T细胞（TMem 细胞）和耗竭T细胞（TEx 细胞）。TMem细胞包含异质性的淋巴细胞亚群，具有不同的持久性和产生效应细胞后代的能力。处于不同分化阶段的TMem细胞——即干细胞记忆T细胞（TSCM 细胞）、中央记忆T细胞（TCM细胞）和效应记忆T细胞（TM细胞）——也可以在血液、次级淋巴器官和外周器官中以高频率发现。TMem细胞的特征都在于表达T细胞特异性转录因子1（TCF1，由TCF7基因编码）、稳态细胞因子受体（如IL-7受体）以及次级淋巴器官的归巢受体，尽管表达水平不同。TMem细胞通常在生理性免疫反应期间产生，当激发性病原体被清除或得到控制时，这有助于建立一个持续存在的抗原特异性T细胞池，以备在抗原再次攻击时发动次级免疫反应。

TME中的第二大类T细胞的特征是高表达一组与“耗竭”状态相关的蛋白质，即程序性细胞死亡蛋白1（PD1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）、淋巴细胞激活基因3（LAG3）、T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3（TIM3）和CD39抗原。这些标志物的表达通常表征处于分化晚期的细胞，由于TME内持续存在的肿瘤抗原提供的慢性抗原刺激，其细胞毒功能受到不同程度的损害。这也伴随着功能适应，因为通常在TEx细胞中观察到趋化因子（如CXCL13）产生的增加。重要的是，在T细胞活化早期也观察到类似标志物的上调，表明“耗竭”T细胞区室可能潜在地包含处于抗原刺激反应不同阶段的T细胞，对应于不同的功能角色。与TMem细胞相反，具有瘤内TEx细胞表型的TIL克隆很少在循环中检测到，而是局限于其同源抗原丰富的部位。

在TME内，慢性抗原刺激通过由转录因子胸腺细胞选择相关高迁移率族盒蛋白（TOX）编排的复杂表观遗传和转录程序，导致效应功能的逐渐丧失。慢性刺激（病毒或肿瘤驱动）小鼠模型的研究已清晰地表明，TOX表达导致终末耗竭T细胞（TTE细胞）和祖细胞耗竭T细胞（TPE细胞）的产生。虽然TTE细胞在转录水平显示效应分子（如PRF1和编码颗粒酶的基因）的产生，但其终末耗竭严重阻碍了它们的细胞毒性潜能，导致缺乏再生功能性效应器能力且易于发生激活诱导细胞死亡的非功能性T细胞反应。即使终末分化，TTE细胞仍能以抗原依赖性方式增殖，从而解释了它们在TME内的数量优势，在那里它们可能表现出对增殖肿瘤细胞的首次快速（功能失调的）控制；TTE细胞区室也可以由TPE细胞补充，TPE细胞代表TEx细胞的储备库，由于保留了TCF1的表达，仍然能够自我更新和分化。虽然TPE细胞缺乏主要的细胞毒性特性，但它们有助于再生由终末分化效应T细胞构成的防御线。

最后，一部分TEx 细胞显示出组织驻留记忆T（TRM）细胞的转录特征。由于TRM细胞标志物，如αE整合素（也称为CD103）和T细胞中BLIMP1同源物转录因子（HOBIT），通常与PD1、CD39和其他耗竭标志物共表达，即使在正常组织中也是如此，因此当在TME中发现时，我们倾向于将这个亚群称为TRM样TEx细胞。虽然很难确定这种细胞是代表慢性抗原刺激后的TRM细胞，还是肿瘤内TTE细胞分化的一种变体，但TTE和TRM样细胞显然代表了TIL表型谱系中的一个连续体。

2. T细胞克隆性

虽然CD4⁺和CD8⁺ T细胞可以以不同的表型存在于TME中，但它们对肿瘤导向免疫的确切贡献最终取决于它们通过TCR接合接收的主要信号。TCR赋予T细胞抗原特异性。在过去十年中，从全外显子组或转录组数据直接测序或推断TCR结构的工具已成为多项实验或计算工作的主题。

TME内优势克隆扩张的证据传统上被用作局部识别肿瘤抗原的间接证据。当应用于基于离散免疫表型标志物分离的TILs细胞亚群时，对此类群体进行TCR测序提供了更详细理解特定T细胞状态在多大程度上优先与TME内克隆性T细胞扩张相关，以及推断TME内T细胞克隆动态和分化树的能力。例如，基于PD1表达分选的黑色素瘤TILs的TCR测序显示，绝大多数扩张的克隆型隔离在耗竭区室内。值得注意的是，大多数TIL克隆在PD1⁺或PD1⁻区室中表现出非重叠分布，从而表明单个T细胞克隆倾向于优先获得耗竭或非耗竭表型。

近年来，单细胞转录组分析与scTCR-seq（检测配对的TCR α链和β链信息）的结合，为表征TME内的克隆型动态提供了前所未有的分辨率。最近对黑色素瘤TILs进行了高分辨率分析，发现TEx细胞区室表现出最低的TCR多样性，这与高度的瘤内克隆扩张一致。来自TEx细胞的TCR克隆也可以在TPE和TTE细胞簇中追踪到，这表明至少在这种肿瘤类型中，这些细胞状态之间存在分化谱系的连续性。

总体而言，对T细胞克隆的组织分布和扩张水平的分析表明，TEx TILs是抗原特异性针对肿瘤抗原的T细胞的储存库。这并不奇怪，因为慢性抗原刺激可以产生观察到的进行性功能障碍，导致获得TEx细胞表型，并损害生成能够在全身再循环的TMem细胞池。

3. 定义具有肿瘤特异性反应性的TILs

T细胞克隆型在TME内的定位在过去被认为是抗肿瘤特异性的间接证据。然而，现在有几项研究证明，大部分TILs缺乏任何抗肿瘤特异性。研究表明，在一大群肺癌和CRC患者中，具有非耗竭表型的CD8⁺ TILs识别广泛的病毒表位，源自地方性病毒，如EB病毒、人巨细胞病毒和流感。由于缺乏激活或耗竭标志物以及无法识别肿瘤抗原，TME中存在的此类TMem 细胞被归类为“旁观者”。

因此，“真正”抗肿瘤TILs的表征需要与旁观者区分开来，即证明T细胞对肿瘤细胞或肿瘤抗原的反应性才能被归类为前者。Gros等人和Pasetto等人首先证明，在黑色素瘤中，表达抑制性受体（如PD1、LAG3和TIM3）的CD8⁺ TILs在纯化并在体外用自体肿瘤细胞挑战时，显示出最高水平的激活、效应细胞因子分泌和靶标裂解。这表明，尽管具有耗竭表型，这些细胞仍保留了一定水平的功能能力。

在TME中检测到如此大量的病毒特异性旁观者T细胞提出了一个尚未解决的问题：它们是如何以及为何被招募到TME的。推测旁观者招募可能以抗原非依赖性方式发生，另外不能排除，一旦到达那里，它们可能在炎症信号的触发下，通过间接和TCR非依赖性激活潜在地参与抗肿瘤活性。

4. 探究TIL TCRs的抗肿瘤反应性

一系列深入研究一致证明，实体瘤中的肿瘤特异性T细胞几乎完全存在于TEx细胞区室中，在不同肿瘤类型中共享非常相似的转录和表型特性。此外，由于这些研究评估了跨不同抗原类别的肿瘤反应性，因此可以得出结论，是肿瘤表达抗原的特异性，而不是抗原类别本身，驱动了TME内的T细胞耗竭。肿瘤反应性TILs的特征现在越来越多地用于预测肿瘤活检中推定的肿瘤反应性TILs：在TILs中检测PD1和CD39的表面表达可以整合到临床分析中，以量化可能对肿瘤抗原特异性的T细胞。TILs水平的评估已越来越多地被用作许多具有高肿瘤突变负荷的实体瘤的预测指标，因为它与免疫治疗后改善的结局相关。

另外，应对CD4⁺ TILs进行单独考虑。相对较少的研究关注辅助T细胞，但单细胞测序和TILs反应性筛选的广泛使用现在提供了证据，表明它们对私有新抗原和肿瘤相关抗原都具有特异性，并将它们与意想不到的丰富T细胞状态联系起来，包括细胞毒性TEx、TPE和TTE细胞。研究表明，黑色素瘤特异性CD4⁺ T细胞可以在TME中被抗原呈递细胞间接激活，这些细胞从凋亡的癌细胞中摄取肿瘤抗原，并在HLA II类背景下呈递它们。令人惊讶的是，CD4⁺ TILs也可以直接识别黑色素瘤细胞，并显示出细胞毒性特性。此外，虽然肿瘤特异性Treg细胞TCRs可以被癌细胞刺激，但目前尚不清楚肿瘤细胞是否能诱导具有免疫抑制功能的CD4⁺ TILs，或者更可能通过抗原模拟来招募预先存在的Treg细胞。未来的研究将需要评估肿瘤特异性Treg细胞如何在TME内或外分化。