合成生物学被誉为第三次生物技术革命，正以其颠覆性的创新力量驱动着下一代生物制造与未来生物经济的行业变革。

根据麦肯锡预测，到2025年，合成生物学与生物制造的经济价值将达到1000亿美元，未来全球经济活动中，60%的物质产品可以由生物技术生产。在2030年至2040年间，合成生物技术每年将为全球带来2万亿至4万亿美元的直接经济效益。
而这高达4万亿美元经济效益的核心之一，在于DNA的合成与改造。人工合成的DNA为合成生物学基础研究和应用领域提供了关键核心原料。但是，目前DNA合成面临两大挑战——长度限制和复杂结构。它们限制了更长、序列特定的DNA的高效合成。其中，长DNA更是驱动更高层次的生物工程设计的关键因素。
下一代DNA合成先驱Ansa Biotechnologies（以下简称“Ansa”）率先解决了长DNA合成的难题。
2023年3月，Ansa宣布，成功从头合成了1005个碱基的DNA序列。据新闻稿报道，这是目前世界上单次合成最长的DNA寡核苷酸。合成的1005个碱基长度的DNA序列包含了用于开发基因治疗的AAV病毒载体关键部件，且包含复杂的强二级结构和高GC含量。其结构和序列特征对于使用传统化学合成方法合成短核苷酸再组装的方式极具挑战性。在此次合成的序列中，有28%的序列完全正确。这意味着，在合成过程中平均每步收率约为99.9%。
Ansa首席科学官兼联合创始人Daniel Lin Arlow博士当时表示：“寡核苷酸合成的下一个前沿是基因长度序列的直接合成。1005个碱基长度的DNA合成是该领域的一个重大里程碑。”

  4年融资近6亿，

15位投资者支持

Ansa成立于2018年，总部位于美国加利福尼亚，由两位DNA合成领域专家——Daniel Lin-Arlow和Sebastian Palluk联合创立。目前，Ansa正在致力于构建快速、可靠的DNA合成服务，以加速合成生物学研究。
Ansa的核心技术是一种基于酶的新型DNA合成方法，正是由Daniel Lin-Arlow和Sebastian Palluk联合开发。
作为Ansa的首席科学官兼联合创始人，Daniel Lin-Arlow在DNA合成领域积累了10余年的研究经验。本科期间，他在麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所Vamsi Mootha实验室开发了用于分析基因表达调控的计算工具。博士期间，他在Jay Keasling实验室研究开发了DNA从头合成的新技术。目前，他在《Nature》《Science》《Cell》等杂志上发表的论文被引用超8000次，是多项专利的共同发明人。
Sebastian Palluk目前担任Ansa的首席技术官兼联合创始人。他是德国达姆施塔特工业大学的生物分子工程硕士，硕士论文研究主题是计算研究末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal transferase，TdT）与可逆的终止子核苷酸（RTdNTPs）从头合成 DNA 的相容性。2015年，Sebastian Palluk在劳伦斯伯克利实验室的联合生物能源研究所攻读博士。
博士期间，Sebastian Palluk与Daniel Lin-Arlow合作开发了第一个TdT酶法合成方法，并将成果发表在《Nature Biotechnology》上1。该篇论文也成为了Ansa诞生的基础。
2024年2月，Ansa还吸引了一位拥有30多年生命科学行业经验的资深人士——Jason Gammack加入并担任首席执行官。Jason Gammack的加入，将加速Ansa推进完成复杂合成基因和基因片段的“Early access”计划，并为公司推出全面的商业服务做准备。
凭借团队优势和技术积累，Ansa备受资本市场青睐。在4年时间里，公司已完成6轮共8340万美元（约合5.98亿元）的融资，其中投资者包括RA Capital、Horizons Ventures以及Fifty Years等15家知名投资机构和企业。
图片Ansa融资历程 图源：Crunchbase官网

无需组装即可直接合成长达600bp的DNA序列

酶促DNA合成技术是一种利用酶的催化作用来合成DNA分子的生物技术。与传统的化学合成技术相比，其在合成长度、效率、成本等多个方面具有显著优势，被认为是能够引领DNA合成技术变革的下一代技术。
在使用该项技术合成DNA序列的过程中，DNA聚合酶起着至关重要的作用。DNA聚合酶能够以DNA为模板，将脱氧核苷酸逐个连接并形成新的DNA链。其具有催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键的活性，从而实现DNA的合成。
通常情况下，聚合酶使用DNA模板扩展引物。不过，TdT是一个特殊的DNA聚合酶。它具有无模板依赖的快速聚合活性，整个催化过程中无需经过变性、复性和延伸反应，仅依靠单链DNA即可实现长链DNA合成。此外，TdT对底物的选择性较低，同时对所有脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）均有较快的催化反应速率，任意的dNTP、核糖核苷三磷酸（rNTP）、修饰的核苷三磷酸类似物都可作为其底物。
不过，天然的TdT只能在DNA链末端随机添加新的dNTP，无法对链合成的过程进行精确控制，难以满足人工DNA合成的实际需求。
对此，Ansa开发了一种独特的酶促DNA合成技术。该技术采用的是一种名为“TdT-dNTP”的偶联物。它是一种能够快速且可控地将单碱基添加到DNA序列中的酶试剂。它通过将单个dNTP分子束缚在TdT上制备，TdT可以利用它连接的一个dNTP将DNA序列延伸一个碱基。
具体到该项技术的DNA合成过程：
第一，将附着在固体载体上的DNA引物暴露于第一个所需碱基的TdT-dNTP偶联物，以添加到序列的引物中；
第二，偶联物使用其束缚的dNTP延伸引物，并保持与3'端的共价连接，从而阻止其他偶联物进一步延伸引物；
第三，用试剂洗去多余的偶联物并切割连接器接头以将TdT从引物中释放，从而实现后续延伸；
第四，利用偶联物序列多次重复该过程，最终合成所需的DNA序列。
值得注意的是，Ansa的dNTP偶联物可以每10—20秒添加一个新碱基。这意味着，Ansa此前合成的长达1005个碱基的DNA序列不到6个小时即可完成。
 
Ansa酶促DNA合成技术运作过程 图源：Ansa官网
Ansa表示，该项技术曾实现无需组装即可直接合成长度超过1000个碱基的DNA序列。截至目前，Ansa能够无需组装、直接合成长达600个碱基对（bp）的DNA序列。
其官网显示，与其他DNA合成技术相比，Ansa的酶促合成技术具有三大关键优势——其一是能够快速合成长且复杂的DNA序列，其二是合成过程完全酶促、不损伤DNA，其三是针对速度和可靠性进行优化的简单流程。
基于独有的酶促DNA合成技术，Ansa开发了一系列高度多路复用的定制仪器。这些仪器使用其TdT-dNTP偶联物合成DNA。此外，仪器的DNA合成过程由定制的信息软件协调控制，以保证所有合成的DNA序列都按照行业标准进行生物安全筛查，从而确保合成产品质量的可靠性。
目前，Ansa可提供序列完整的克隆合成基因以及具有复杂结构和序列特征的DNA片段，其DNA合成技术可服务医疗保健与制药、生物研究、食品与农业、工业生物技术等多个行业。
图片Ansa产品类型 图源：Ansa官网

DNA合成产品已投入商用，加速突破复杂DNA序列合成极限

2023年4月，在成功从头合成1005个碱基的DNA序列后，Ansa宣布启动一项克隆合成基因早期获取计划，以帮助研究人员获得难以合成的DNA序列。1个月后，Ansa向第一个客户Enoda交付了具有高GC和AT含量的启动子序列。
2024年5月，Ansa再次宣布扩大其复杂DNA合成服务早期获取计划，以加速医疗保健、生命科学研究和其他基于DNA合成技术支撑的众多行业的创新。
2024年7月，在两次合成DNA产品早期获取计划的基础上，Ansa正式宣布其克隆合成DNA和合成DNA片段两大产品投入商业使用。
Ansa首席执行官Jason Gammack在新闻稿中表示：“通过推出这款产品，我们期待让更多科学家能够自由发挥想象力，这将进一步推动医疗保健、生命科学研究等行业实现全新的突破。”
不过，值得一提的是，Ansa的酶促DNA合成技术并非十全十美。回到该酶促DNA合成技术的具体过程，在合成的第三个步骤中，需要使用试剂洗去产物中多余的偶联物并切割连接器接头。但当接头断开时，连接子会在核碱基上留下化学残留物或化学疤痕。这意味着，从分子的角度来看，最终合成的DNA产品不是一个纯的DNA分子，而这也可能将会影响DNA合成产品的下游应用。
针对这一情况， Daniel Lin-Arlow和他的同事开发了一种改良的接头设计，以限制或避免在合成过程中产生化学疤痕。具体来说，Ansa将使用微电极阵列上的电化学氧化对偶联物进行切割，以使疤痕变小。不过，这也并非完美解决方案，该方法并不能完全消除疤痕。此外，如若电化学裂解条件控制不佳，生长寡核苷酸中醇3和鸟苷残基之间的氧化电位差距相对较窄，将有可能造成氧化损伤2。
然而，尽管Ansa的酶促DNA合成技术解决方案还存在一定的局限性，但不可否认的是，该项技术突破了传统DNA合成技术的瓶颈，为合成生物学领域带来了新的机遇。它使得合成更长、更复杂的DNA序列成为可能，为基因编辑、药物研发等领域提供了更高效的DNA合成工具。此外，该技术的发展也有望降低DNA合成的成本，提高合成效率，加速基于DNA合成技术支撑的众多领域的发展。
目前，Ansa正在优化和改进酶促DNA合成技术，以进一步提高接头设计的合理性，从而最大程度地减少化学疤痕的产生，并降低氧化损伤的风险。同时，Ansa 也在加强对电化学裂解条件的控制和研究，力求找到最佳的参数设置，以确保合成过程的稳定性和可靠性。
Ansa首席科学官兼联合创始人Daniel Lin-Arlow也表示：“我们的研发团队正在努力提高合成平台的性能，以期为客户提供更好的DNA合成产品。其中，在2024年，Ansa预计将推出数千个碱基长的DNA构建体。”
参考资料：
1. Palluk S, Arlow DH, de Rond T, Barthel S, Kang JS, Bector R, Baghdassarian HM, Truong AN, Kim PW, Singh AK, Hillson NJ, Keasling JD. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates. Nat Biotechnol. 2018 Aug;36(7):645-650. doi: 10.1038/nbt.4173. Epub 2018 Jun 18. PMID: 29912208.
2. Spatially Selective Electrochemical Cleavage of a Polymerase-Nucleotide Conjugate.Jake A. Smith, Bichlien H. Nguyen, Rob Carlson, Jeffrey G. Bertram, Sebastian Palluk, Daniel H. Arlow, and Karin Strauss.ACS Synthetic Biology 2023 12 (6), 1716-1726.