赖氨酸定点偶联技术在抗体偶联药物的应用

传统的赖氨酸偶联ADC药物采用非定点偶联技术，代表性药物有Kadcyla、Mylotarg、Besponsa。天然存在于赖氨酸侧链中的氨基，是与单抗偶联最方便的官能团，其不需要预先的化学修饰步骤。虽然由于其高的pKa(~10.5)，大部分蛋白质在中性pH下被质子化，但蛋白质中仍有一小部分氨基将以中性、未质子化的形式存在。赖氨酸侧链中的氨基在亲核性方面仅次于硫醇基团，但明显领先于其他的氨基酸的侧链(如精氨酸、丝氨酸、色氨酸、蛋氨酸)。然而由于赖氨酸的大量存在，有限数量的选择性偶联是非常具有挑战性的，因此赖氨酸偶联的ADC通常显示出广泛的DAR分布，例如lgG分子具有超过80个赖氨酸残基，其中溶剂可及性高的位点超过20个。

Kadcyla 结构

但是传统的赖氨酸偶联ADC药物采用非定点偶联技术，因此产品均一性较差，这种DAR与偶联位点的变化对临床效果产生不良影响。为了解决这个问题，科学家提出较多赖氨酸定点偶联技术，如选择性修饰活性最强的赖氨酸，通过酶实现定点修饰等。

pClick技术

pClick技术是无需抗体工程或复杂的反应条件的便捷方法。这种亲和肽方案由Han团队首创，他们选用来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的B结构域(FB蛋白)合成含非天然氨基酸的肽，由FB蛋白实现有利定位和接近，选择性非天然氨基酸与特定赖氨酸反应。当选用曲妥珠单抗(Tras)和FB-E25FPheK(4-氟苯基氨基甲酸酯赖氨酸)突变体作为模型底物时，研究人员证明过量的FB-E25FPheK突变体进行48 h的偶联反应可使Tras-FB偶联物的偶联产率>95%而单一修饰位点K337。

AJICAP技术

AJICAP技术是一类使用Fc(抗体可结晶片段)亲和试剂对天然抗体进行位点特异性修饰的方法。

第1代AJICAP利用Fc亲和肽试剂实现偶联后，用三(2-羧乙基)膦[tris (2-chloroethyl) phosphate，TCEP]还原以在特定赖氨酸上安装硫醇基团，而后用去氢抗坏血酸氧化重建因还原而裂解的抗体链间二硫键，由此成功地修饰了位点K248。

但再氧化步骤往往导致二硫键被扰乱与聚集性问题，所以第2代AJICAP避免了氧化还原处理，直接采用连接子裂解反应，除与K248成功偶联外，使用具有适当间隔子的恰当Fc亲和肽试剂还能合成与K288偶联的ADC。

基于此技术，韩国公司Abtis发展的一种ADC定点偶联技术—AbClick®。该技术平台通过亲和肽辅助，实现精准高效的抗体-药物偶联，在天然抗体的248位置的赖氨酸进行定点偶联。

^{（图片来源：AbTis官网）}

吲哚-3-丁酸 (indole-3-butyric acid，IBA)衍生肽邻近诱导技术

Rajagopalan团队发现，抗体的轻链与重链之间存在着高度保守的核苷酸结合域(nucleotide binding domain，NBD)，这种存在于所有免疫球蛋白Fab(抗原结合片段)组的特性为其广泛的应用创造了可能。通过建模分析与计算机筛选，Bilgicer团队确定IBA对该NBD有高亲和力，Kd(dissociation constant)值范围为1~8 μmol·L⁻¹，具体取决于抗体。于是他们设计了依靠IBA偶联抗体核苷酸结合位点的紫外光交联方法，并发现在紫外光不至损伤抗体活性的情况下最多能实现1.41个偶联。

为了避免紫外光对抗体的影响，Lam团队对亲和试剂进行了优化。他们发现带负电荷的氨基酸可增强对NBD的亲和力和交联能力，于是采用OBOC组合肽库和新颖的筛选策略确定亲和元素天冬氨酸和丝氨酸残基(DS肽)，再结合1,5-二氟-2,4-二硝基苯以实现对核苷酸结合位点的不可逆连接。

关键点定向修饰技术(linchpin-directed modification，LDM)

关键点定向修饰技术是Rai团队首创的，他们通过可逆的分子间反应将“关键点”放置在所有可及的特定氨基酸残基上，再使另一官能团不可逆地选择性修饰邻近的特定基团，最后解离关键修饰，完成对蛋白质的特异性修饰。其中，他们使用间隔子调整以精确匹配邻近修饰的相对方向。最初，研究人员设想通过关键修饰高丰度的赖氨酸来实现对低丰度氨基酸的特异性修饰，并成功获得了选择性良好、对肿瘤细胞抑制效果好的DAR 4的ADC。但这样的策略很难在复杂混合物中精确修饰单个蛋白质，于是研究人员设想通过关键修饰半胱氨酸实现对邻近赖氨酸特异性修饰(LDM_C–K)。他们首先用TCEP处理单克隆抗体以减少二硫醚并引入游离半胱氨酸，再利用LDM_C–K技术得到定点修饰的醛抗体偶联物(antibody-aldehyde conjugate，AAC)，用美登素DM1的羟胺衍生物处理得到ADC。

赖氨酸特异性试剂

Bernardes等人也报道了特定部位的赖氨酸酰化反应。使用从计算机辅助预测的具有最低pKA的抗体赖氨酸的试剂，在略碱性pH的酰化反应将在动力学上有利的。研究发现磺酰基丙烯酸酯仅使用单摩尔当量(37℃，pH 8.0)就能快速进行反应，使得曲妥珠单抗轻链Lys207的定量和不可逆修饰，并完全保留天然二级结构和功能。