「网络药理学」是一门新兴的交叉学科，它将生物信息学、网络理论、药理学等多学科的知识和技术融合起来，从系统的角度研究药物与生物体内复杂网络之间的相互作用。
网络药理学最早于2007年被提出。我国学者李梢等首次报道了中医寒热证生物分子网络和寒热方剂的网络调节效应，提出了基于生物网络的中药方剂研究框架。同年，英国邓迪大学的Hopkins提出了“网络药理学（Network Pharmacology）”的概念。
简而言之，网络药理学是通过分析药物与生物分子网络（如蛋白质、基因等）的关联，揭示药物的作用机制和效果。它不仅仅关注单一的药物靶点，而是从整体上考察药物对生物体内多个靶点的影响，以及这些靶点之间的相互关联。
网络药理学的研究方法包括构建药物-靶点网络、蛋白质-蛋白质相互作用网络等，通过计算和分析这些网络的拓扑结构、动态变化等特性，来预测药物的作用效果和可能的副作用。总的来说，网络药理学是一种更加全面、系统的药物研究方法，它为新药研发提供了全新的思路和技术手段，让药物研发变得更加精准和高效。
以Network Pharmacology为关键词进行检索会发现，随着“网络药理学”概念的提出，相关文章的数量逐年增加且增速极快，2024年至今的总发文量已达7243篇，可谓是“经久不衰”“火爆如初”。

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图源：pubmed
为什么同样是网络药理学，别人就能发Nature子刊？如何利用网络药理学斩获高分期刊呢？相关研究该如何开展呢？
让我们通过一篇发表在Scientific Reports上的最新文章《基于网络药理学、分子对接和动力学分析，预测生姜成分对冠状病毒感染的抗病毒活性》，初步探索网络药理学的实际应用。

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https://doi.org/10.1038/s41598-024-60721-3
一、背景
传统医学中的天然产物及其衍生物一直被视为潜在的治疗资源。中国国家卫生健康委员会发布了中草药单药或与西医结合的方案，其中生姜作为一种传统草药，被选中进行深入研究。
实验研究表明，生姜化合物对HRSV、CHIKV及IAV（包括H1N1、H5N1和H9N2亚型）具有抗病毒活性。姜黄酮A能抑制IAV复制。临床试验显示，富含生姜的肠内饮食可能改善急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的氧合，减少机械通气和ICU住院时间。研究还发现，部分生姜衍生物与SARS-CoV-2的Mpro及受体对接，表现出潜在抑制作用。此外，姜辣素及姜醇等生姜成分能抑制病毒侵入。生姜提取物及生姜银纳米颗粒对某些病毒有良好效果。在多个国家的研究中，食用生姜或与其他草药联用能降低COVID-19患者的住院率或减轻症状。
研究者采用了一种结合网络药理学、分子对接和动力学分析的计算方法，从34种姜黄素化合物中筛选出最具潜力的抗病毒姜黄素成分，有助于了解其潜在的抗病毒作用机制。

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图1 文章流程图

注：综合网络药理学、分子对接和动力学分析方法，然后通过实验验证验证生姜生物活性化合物的抗病毒活性 
二、研究方法
（一）网络药理学分析
首先采用网络药理学的方法，构建了生姜化合物的网络，并分析它们与SARS-CoV-2相关蛋白的相互作用。通过分析这个网络，能够识别出与病毒感染密切相关的靶点，并筛选出可能与这些靶点结合的姜黄素成分。
1. 化合物与靶基因收集：
  • 研究对象：生姜根状茎中的化学物质。
  • 数据来源：PubMed和谷歌学术。
  • 筛选标准：RO5和Swiss-ADME分析，仅纳入符合RO5标准的化合物。
2.靶基因检索：

  • 使用SEA、TargetNet和瑞士战略预测等数据库收集靶基因。

  • 综合处理不同数据库的命名格式。
3.网络药理学分析：

  • 聚类枢纽网络为子网络，揭示生物学见解。

  • 功能富集分析（GO术语和通路），FDR值≤1×10−6，优先排序重要项。
4.SARS-CoV-2-人PPIs检索与叠加：

  • 从BioGRID4.4检索SARS-CoV-2-人PPIs。

  • 叠加在姜枢纽网络上，突出病毒蛋白与姜成分的相互作用。

（二）分子对接模拟
为了验证生姜化合物与病毒蛋白的结合能力，文章进行了分子对接模拟。这是一种计算机模拟技术，用于预测小分子化合物（如姜黄素成分）与生物大分子（如病毒蛋白）之间的的结合方式和强度。
本研究通过分子对接模拟探索了生姜成分与SARS-CoV-2病毒蛋白及人体ACE2受体的潜在结合能力。
1.晶体结构获取：从PDB检索SARS-CoV-2的Mpro（[PDB ID: 6Y84）、RBD-ACE2结合体（PDB ID: 6M0J）及ACE2（PDB ID: 1R4L]）的晶体结构。见表1
2.蛋白配体准备：使用MOE去除水、离子，保留关键氨基酸，加极性氢，允许特定侧链翻转。   
3.结合口袋选择：

  • Mpro：基于催化二联体位置选；

  • RBD-ACE2：共晶配体位点；

  • Mpro对接位点：参考文献。
4.能量最小化：使用AMBER10:EHT力场，RMS梯度至0.1 Kcal/mol/Å。
5.分子对接：选定口袋中对接，使用三角形匹配器，评估london dG和GBVI/WSA dG。
6.对接结构精炼：保留每个化合物30个最佳结构，验证RMSD值。
7.结果分析：确定生姜成分与病毒蛋白和ACE2的潜在相互作用，评估抗病毒潜力。

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表1 对接模拟中靶蛋白的结合口袋

（三）分子动力学模拟
文章还采用了分子动力学模拟，以进一步了解生姜化合物与病毒蛋白在动态环境中的相互作用。这包括模拟化合物与靶点的结合过程、评估结合的稳定性和持久性，以及预测化合物对病毒复制和感染过程的影响。
1.化合物选择：选取(6)-gingerdiacetate选为研究对象，因其对三目标蛋白有最佳结合力。
2.MD模拟使用：GROMACS软件进行100ns MD模拟。   
3.软件与力场：CHARMM36（蛋白）与CGenFF（配体）力场。
4.溶剂化与中和：SPC水模型，钠/氯离子中和。
5.预处理：能量最小化与系统平衡。
6.生产模拟：300K，1atm，2fs时间步长。

7.数据分析：RMSD，Rg分析，Grace绘图。

（四）实验

通过实验验证生姜生物活性化合物的抗病毒活性。从开罗农业部农业研究中心获取的新鲜生姜根茎的采集、经过水蒸馏提取挥发油、GC-MS及顶空GC-MS分析，对生姜提取物的进行LC-MS/MS分析及HPLC定量测定辛辣物质，并进行MTT细胞毒性试验和生姜对SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性测定。

三、结果
（一）网络药理学分析结果
生姜化合物靶基因分析揭示了与病毒感染不直接相关的细胞过程。通过综合多个数据库，确定了生姜中的多种化合物及其对应的靶基因。构建了一个包含草药-化学物质-靶标相互作用的网络，并分析了其拓扑参数，如度中心性。识别出284个节点（包括1个草药、34种化学物质和249个靶标）构成的子网络。
该枢纽网络被聚类成7个高度连接的基因组，这些基因组被定义为网络模块。由于其中两个模块规模太小（每个包含2个基因），因此被移除。而其他五个模块的大小范围在21到107个节点之间，见图2。节点的颜色深浅代表其度中心性，而节点的大小则代表相应化学成分的数量。
功能富集分析显示，这些靶基因涉及多种生物过程，如细胞周期、细胞通信、凋亡和炎症反应等。每个模块的最主要的GO术语和通路见表2、表3。

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图2 枢纽标靶网络

 

 

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表2 五个包含枢纽基因的模块所富集的GO术语

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表3 五个包含枢纽基因的模块所富集的Reactome通路

SARS-CoV-2与人类的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）叠加到生姜枢纽网络后，识别出71个与27种病毒蛋白相互作用的靶基因。其中，膜蛋白M、包膜蛋白E和刺突蛋白S等结构蛋白以及与多个靶标有相互作用的辅助蛋白和非结构蛋白均位列前10。与病毒蛋白连接最多的人类靶标来自不同网络模块，且至少与7种病毒蛋白相连。为了综合观察，构建了一个完整的网络，将所有类型的节点（1种草药、34种化学成分、245个相应的枢纽靶标和27种SARS-CoV-2病毒蛋白）以及不同的相互作用类型结合起来，见图3。

 

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图3  由307个节点和5889条边组成的综合网络

 

 

（二）分子对接模拟结果

分子对接模拟结果显示，(6)-姜二乙酸酯在与Mpro、ACE2以及刺突蛋白的受体结合域（RBD）的对接评分中表现最佳，并且与Mpro和ACE2形成了比其他配体更多的氢键。基于对接评分排在前六位的成分见表4。

 

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表4 排名前六的姜成分与目标蛋白的（千卡/摩尔）对接分数

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图4 (6)-姜二乙酸与目标蛋白之间蛋白质配体相互作用的二维表示

（三）分子动力学模拟结果
研究者对(6)-姜二乙酸酯与RBD和ACE2的复合物进行了100ns的分子动力学模拟，结果见图5，图6。结果表明，(6)-姜二乙酸酯与RBD和ACE2的结合具有很高的稳定性。与SARS-CoV-2 Mpro的结合在55ns后失去了稳定性。总体而言，(6)-姜二乙酸酯与这三种靶标蛋白展现出了良好的相互作用和稳定性，这表明它有可能成为SARS-CoV-2的抑制剂。
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图5 在100ns的模拟运行中，目标蛋白在游离态结构（apo结构）与(6)-姜二乙酸酯-蛋白复合物中的均方根偏差（RMSD）图

 

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图6  在100ns的模拟运行中，目标蛋白在游离态结构（apo结构）与(6)-姜二乙酸酯-蛋白复合物中的回转半径（Rg）图

（四）实验验证结果
研究者提取了生姜的水醇提取物，并检测到其中含有(6)-姜二乙酸酯。实验验证了生姜水醇提取物和(6)-姜二乙酸酯的抗病毒活性。结果显示，生姜水醇提取物和(6)-姜二乙酸酯具有较强的抗病毒活性，其半抑制浓度值较低。
生姜根茎水蒸馏（HD）油的气相色谱-质谱（GC–MS）分析结果见表5。顶空气相色谱-质谱（GC–MS）分析结果见表6。生姜水醇提取物的液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）分析结果见表7。高效液相色谱（HPLC）对生姜醇提物中的辛辣成分定量测定结果见表8及图7。生姜水蒸馏油（a）和生姜醇提物（b）的剂量反应和抑制曲线见图8。

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表5 气相色谱-质谱法分析生姜水蒸馏（HD）油的挥发性成分

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表6 生姜根茎顶空气相色谱-质谱（GC–MS）分析

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图7 姜汁水醇提取物的HPLC色谱图

 

 

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表7 生姜水醇提取物的液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）分析

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（上）表8 姜水醇提取物中刺激性物质的定量测定

 

（下）图8 生姜水蒸馏油与生姜醇提物的剂量反应及抑制曲线

四、总结

该研究通过网络分析、分子对接和分子动力学模拟预测生姜中生物活性成分对抗SARS-CoV-2病毒的潜力。网络药理学研究表明，生姜化合物可能通过包括细胞周期、细胞通讯、凋亡和炎症反应在内的多种生物过程间接影响病毒在宿主细胞中的存活。分子对接和分子动力学模拟鉴定出(6)-姜二乙酸酯能够与SARS-CoV-2病毒的刺突受体结合域（RBD）和人体血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，可能阻止病毒附着到宿主细胞上。最后，在实验检测中，生姜醇提物中检测到了(6)-姜二乙酸酯，且该醇提物显示出比生姜水蒸馏油更高的抗病毒活性，即生姜醇提物的高活性可能归因于(6)-姜二乙酸酯的存在。该研究为生姜作为潜在抗病毒药物的开发提供了科学依据。

参考资料：Samy A, Hassan A, Hegazi NM, Farid M, Elshafei M. Network pharmacology, molecular docking, and dynamics analyses to predict the antiviral activity of ginger constituents against coronavirus infection. Sci Rep. 2024 May 27;14(1):12059. doi: 10.1038/s41598-024-60721-3. PMID: 38802394; PMCID: PMC11130167.      

 

 

撰写：丝瓜
编辑：小饼干