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引言

上世纪80年代，首批重组蛋白药物获批上市，标志着生物医药进入全新纪元。如今，全球70%的重磅生物药依赖重组蛋白技术，覆盖癌症、自身免疫病、传染病等重大疾病治疗。这场革命的基石，正是不断迭代的蛋白表达系统——它不仅是实验室工具，更是现代医学的“分子药厂”。

从胰岛素到单克隆抗体，治疗性蛋白的规模化生产依赖于表达系统的持续革新。随着基因工程技术的突破，表达系统已从单一的原核体系发展为覆盖原核、真核乃至无细胞的多维技术网络。


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一、原核表达系统

在过去的四十年里，大肠杆菌一直是蛋白质表达的主要宿主。细菌系统的广泛使用主要来自实验室环境中实施的低成本、最低的技术要求和细菌培养的极短倍增时间。同时，细菌培养物可以很容易地扩大规模，以实现高通量处理所需的自动化。细菌表达系统成功适应大规模生产项目的例子有很多，包括筛选数百个表达克隆和大规模生产选定的蛋白质。

尽管细菌表达系统一直是蛋白质表达研究的“主力”，但在真核蛋白质的表达方面，该系统存在许多局限性。大肠杆菌是一种原核生物，其细胞结构与真核生物非常不同，其更简单的机制无法正确折叠外源蛋白，也无法进行天然表达的真核蛋白中常见的翻译后修饰（PTM）。因为大肠杆菌表达的真核蛋白质具有非常小的PTM，这些蛋白质通常没有正确折叠，因此有时是不溶的。在某些情况下，这些限制可以通过使用转基因细菌表达菌株、改变蛋白质纯化标签或进行额外的蛋白质复性步骤来规避。


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二、酵母表达系统

酵母细胞是真核生物，因此，它们具有多细胞生物的复杂生物学特性，能够产生进行蛋白水解加工和脂质化等PTM的蛋白质。与细菌相似，酵母在基因上易于操纵，生长速度快，在培养中可以实现高细胞密度。酵母蛋白表达常用于研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-DNA相互作用。然而，由于酵母中存在的内蛋白酶和外蛋白酶对表达的蛋白质的快速降解，从酵母培养物中回收大量所需的蛋白质可能很困难。此外，由于低聚糖结构与人类糖蛋白和糖基化模式（高甘露糖化）的差异，许多酵母生产的重组蛋白不适合制药应用。

广泛用于生产功能性蛋白质的酵母有巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和多形汉萨酵母。例如，酵母表达系统通常用于生产G蛋白偶联受体（GPCR），这是一个跨膜受体的大蛋白家族，可以感知细胞外的分子并激活细胞反应。蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母正在成为最受欢迎的酵母表达系统之一，并已成功用于生产高达0.35mg/L培养物的膜蛋白。


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三、哺乳动物表达系统

哺乳动物表达系统通常是制造生物制药的首选平台。近年来，观察到这些表达系统的使用稳步增加。这是因为人们对生产需要特定翻译后修饰（最明显的是糖基化）的大型复杂分子的需求越来越多，这些修饰仅发生在哺乳动物表达系统中。此外，在哺乳动物细胞系和一般动物细胞系的情况下，大多数重组蛋白可以分泌，不需要像原核表达系统那样对细胞进行裂解来提取，随后进行蛋白质折叠。
然而，由于可能受到动物病毒的污染，细胞系中的蛋白质生产引发了潜在的安全问题。细胞系中蛋白质生产的其他缺点包括复杂的营养需求、缓慢的生长和脆弱性，以及相对较高的生产时间和成本。目前可用的哺乳动物表达系统包括中国仓鼠卵巢细胞、啮齿动物细胞系（如NS0、BHK和Sp2/0）和人类细胞系（例如HEK293、PER.C6、HT-1080和CAP）。在现有的哺乳动物细胞系中，中国仓鼠卵巢细胞系是重组蛋白生产的主要选择，2016年最畅销的10种生物制药中有7种是在这些细胞中生产的。

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四、昆虫细胞表达系统

虽然目前生物制药最常用的是哺乳动物表达系统，但其蛋白质产量相对较低，并且需要费力的放大过程。因此，相对来说，它可能是最不经济的表达系统。
昆虫细胞培养解决了人类衍生蛋白质之间糖基化和三维折叠的需求，需要这些特征来进行生物活性，同时避免哺乳动物细胞对可能对人类健康造成问题的病毒污染的敏感性。蛋白质在昆虫细胞中表达，如鳞翅目昆虫，该昆虫属包括蝴蝶和飞蛾。其他常用的昆虫细胞类型包括草地贪夜蛾（秋军虫）、家蚕、卷叶蛾（卷心菜弯虫）和二叶蛾（森林帐篷毛虫）。属于这一组的所有昆虫都容易感染杆状病毒，这种昆虫病毒的遗传物质是将外源蛋白插入昆虫细胞的载体。
大多数杆状病毒表达载体都是基于Autographa californica多核多角体病毒（AcMNPV）。AcMNPV杆状病毒颗粒携带120-150 kb的双链基因组DNA，可以容纳另外100 kb的外源遗传物质，这为插入单个或多个基因表达构建体提供了几乎无限的能力。最常用的杆状病毒启动子之一是polyhedron启动子，它在杆状病毒生命周期的后期调节杆状病毒polyhedron蛋白的表达。
昆虫细胞中的蛋白质表达允许蛋白质PTM（信号肽切割、磷酸化、脂质修饰和糖基化）以及折叠（二硫键形成、寡聚化），类似于哺乳动物细胞。昆虫细胞培养物（SF9、SF21等）易于扩大规模，可以在27°C下作为贴壁细胞和悬浮细胞维持，这对温度敏感突变体的表达至关重要。作为另一个优点，polyhedron启动子在杆状病毒复制周期的后期是活跃的，并且允许有毒基因的表达，对细胞的有害影响最小。杆状病毒只感染昆虫，对人类没有致病性。因此，基于杆状病毒的蛋白质表达只需要生物安全1级。由于以上这些优点，在过去的10年里，杆状病毒蛋白表达系统已被广泛用于酶制造、结构研究的大规模样品制备以及疫苗开发。

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五、植物细胞表达系统

植物源生物制药的生产引起了人们的极大兴趣。转基因植物有可能成为大规模生产人类治疗性蛋白质的成本效益高的系统。植物的使用消除了治疗药物与动物病原体的潜在污染，因为植物细胞培养物不易受哺乳动物病毒病原体的影响，此外，植物病毒不会感染人类细胞。另一个优点是，在可食用植物中表达的口服免疫原性重组蛋白可以在不进行加工的情况下口服给药，去除了昂贵的纯化步骤。此外，植物表达系统能够产生具有复杂糖基化模式的蛋白质；然而，所产生的聚糖结构与人类产生的结构明显不同。
用于重组蛋白生产的植物表达系统的缺点与生产时间过长有关，这使得该技术不适合快速生产对抗新出现疾病的药物。另一个问题是，目前植物生物技术中的方法无法以一致的方式精确控制植物中的转基因表达水平。
作为使用整株植物作为生物反应器的替代方案，在使用植物细胞培养物方面取得了相当大的进展，如胡萝卜悬浮培养物和烟草BY-2细胞。到目前为止，成功生产并在植物中正确折叠的生物制药蛋白质的主要类别是亚单位疫苗和病毒样颗粒（VLP）、抗体和治疗酶，其中包括几种已经完成II期试验并接近商业化的产品。2012年，重组人葡萄糖脑苷脂酶（Elelyso）成为FDA批准用于人体给药的第一种植物生产的生物药。

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六、无细胞蛋白表达系统

蛋白质表达也可以在体外使用纯化的RNA聚合酶、核糖体、转移RNA（tRNA）和核糖核苷酸进行。这些试剂可以通过从细胞或基于细胞的表达系统中提取来生产。因为蛋白质合成发生在细胞裂解物中，而不是在培养的细胞内，这种方法也被称为无细胞蛋白质表达。
无细胞系统的使用正成为基于细胞的蛋白质表达的一种有吸引力的替代方案，因为它提供了一种简单、开放和灵活的方法来快速合成折叠的蛋白质。无细胞系统的开放性使其易于修改，从而允许添加外部分子，为蛋白质折叠和活性创造有利条件。例如，无细胞系统可用于掺入非天然或化学修饰的氨基酸，以协助标记蛋白质用于下游应用。在真核裂解物中可以实现许多PTM：糖基化、肽切割、乙酰化、磷酸化、精氨酸甲基化等。将非天然或化学修饰的氨基酸掺入正在生产的蛋白质中的能力已被应用于基于无细胞系统创建几种蛋白质技术：蛋白质原位阵列（PISA）、核酸可编程蛋白质阵列（NAPPA）、DNA到蛋白质阵列（DAPA）等。无细胞系统仍然被认为是一个相对较新的平台。由于蛋白质表达水平低和成本高，无细胞系统不如基于细胞的系统广泛采用。这些系统需要进一步优化，特别是提高蛋白质产量。

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结语

蛋白表达系统的进化史，本质是精度、成本与效率的三角平衡。原核系统仍是基础研究的利器，哺乳动物细胞保持着治疗性蛋白的主力，而植物与无细胞系统正开辟全新赛道。随着合成生物学与精准医疗的融合，未来或将实现“按需定制表达”——根据蛋白特性自动匹配最优系统。


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